Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

PENTARGETAN SPESIFIK VIRUS HEPATITIS C NS3 RNA HELICASE PENEMUAN INHIBITOR PEMIMIKAN NUKLEOTIDA QU663 YANG BERPOTENSI DAN SELEKTIF KOMPETITIF Puti Sri.

Presentasi serupa


Presentasi berjudul: "PENTARGETAN SPESIFIK VIRUS HEPATITIS C NS3 RNA HELICASE PENEMUAN INHIBITOR PEMIMIKAN NUKLEOTIDA QU663 YANG BERPOTENSI DAN SELEKTIF KOMPETITIF Puti Sri."— Transcript presentasi:

1 PENTARGETAN SPESIFIK VIRUS HEPATITIS C NS3 RNA HELICASE PENEMUAN INHIBITOR PEMIMIKAN NUKLEOTIDA QU663 YANG BERPOTENSI DAN SELEKTIF KOMPETITIF Puti Sri Komala Qomarudin Helmy

2 Pendahuluan  Infeksi virus hepatitis C (HCV) masalah kesehatan serius yang diderita  170 juta penduduk seluruh dunia.  Satu-satunya terapi HCV → INF , sendiri maupun kombinasi dengan nukleotida analog ribavirin → sukses 50%, beberapa efek samping  Alternatif obat → berinteraksi secara selektif dengan enzim komplex replikasi virus, menghambat pertumbuhan virus dengan sedikit atau tanpa toksisitas pada sel host yang tak terinfeksi.

3 Pendahuluan  Penyebab hepatitis C adalah virus HCV → protein nonstruktural (NS) adalah proteases/helicase NS3 → terlibat dalam proses poliprotein virus dan duplikasi genome HCV.  NTPase menghidrolisa ribo- dan deoxy-NTP, serta sebagai analog nukleosida triphosphat → energi untuk reaksi pelepasan yang dilakukan oleh helicase  Aktivitashelicase NS3 → melepaskan homoduplex DNA-DNA dan RNA-RNA, juga heteroduplex RNA-DNA

4  Penemuan molekul baru → menghalangi NS3 helicase (NS3h) dan aktivitas NTPase → sasaran binding site non-nukleosida HIV-1 reverse transkriptase (RT)  Diidentifikasi QX432 → inhibitor HIV-1 berbasis quinoxaline dan QU663 quinoline → menghambat reaksi helicase secara kompotetitif terhadap substrat NA, tanpa mempengaruhi fungsi ATPase → obat anti- HCV baru

5 BAHAN DAN METODA  Quinoxaline QX432 dan QX449; quinoline QU494 dan QU663 (Grafik 1)  Persiapan Substrat Asam Nukleat  Pembuatan susbtrat DNA 5'-end-labeled sp d18:d66-mer  Purifikasi Protein  Escherichia coli DH5  dikotransformasikan dengan plasmid berlabel NS3 → diinokulasi, disentrifugasi → lisis sel, lysate di sentrifugasi  NS3 dimurnikan dari supernatant dengan khromatografi  Percobaan ATPase  Monitoring langsung hidrolisis [  -32P]ATP dengan thin layer chromatography

6  Percobaan Helicase  Larutan: 200 nM NS3, 5 mM Tris HCL (pH 7,5), 5 mM MgCl 2, 25 nM substrat DNA duplex yang berlabel 32P dan 5 mM ATP diinkubasi, reaksi dihentikan buffer → dianalisa pada gel polyacrylamide  Sampel-sampel tanpa substrat NA diukur spektrofotometer  Percobaan absorbance quenching :  50 mM Tris HCL (ph 7,5), 5 mM MgCl, QU663 dan NA (panjang fragment rata-rata DNA 250 bp)  Konst QU663 meningkat dan konst QU663 tinggi  Untuk mengetahui QU663 berikatan dengan DNA

7 Grafik 1 Quinoxaline QX432 dan QX449; quinoline QU494 dan QU663

8 BAHAN DAN METODA Percobaan Electrophoretic Mobility Shift  Larutan: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl2, 5 mM ATP, QU663 dan substrat DNA (p TrC plasmid, 4,4 kb, InvitroGen), diinkubasi, reaksi dihentikan buffer, dirun pada gel agarose 0,75% dengan dan tanpa EtBr.  Percobaan Inhibisi dan Penentuan Konstanta Kinetika  Percobaan inhibisi pada aktivitas ATPase dan helicase → peningkatan jumlah inhibitor (10, 20, 50, 100, 200 dan 500 μM) dan konsentrasi substrat DNA (33, 66,dan 333 nM) → berdasarkan waktu  Data dianalisis sesuai persamaaan eksponensial Dimana A amplitudo burst, k 1 konstanta laju orde pertama apparent pada asosiasi enzim dengan substratnya (burst rate) dan t waktu  Laju katalitik apparent reaksi dan afinitas enzim untuk substrat NA (K NA ) :

9 BAHAN DAN METODA  Kurva dose-response → model Hill, perhitungan pengikatan NS3 ke sustrat DNA. ID50 (konsentrasi inhibitor → inhibisi 50%) Dimana k adalah laju reaksi dengan adanya konsentrasi inhibitor(I), laju reaksi tanpa inhibitor, dan n index kooperasi.

10 Karena konsentrasi enzim tinggi (sesuai konsentrasi substrat DNA) → tidak diabaikan, K i diturunkan dari ID 50 → persamaan Cheng-Prusoff untuk inhibitor kompetitif. Nilai ID 50 dirubah menjadi nilai K i, Dimana [E] adalah konsentrasi enzim total, K d konstanta disosiasi untuk pengikatan DNA dan n index kooperativitas  Pemodelan Molekuler  Percobaan inhibisi HIV-1 RT, Test Anti-HIV sekunder (Percobaan Kultur Sel) dan uji toksisitas.

11 Hasil dan Pembahasan  QU663 merupakan Inhibitor spesifik dari aktifitas Protein HCV NS3 (virus Hepatitis C)  QU663 berkemampuan untuk menghambat NTPase dan aktifitas Helicase dari NS3 (enzim yang bertanggung jawab dalam pembentukan polyprotein virus serta duplikasi dari gen HCV)

12 • Hasil kromatogram dari reaksi ATPase dengan absennya radioaktif ATP (Lane 3) • Adanya radioaktif ATP (Lane 1 dan 2). • Indikasi dari substrat/ATP adalah spot hitam di bawah, • Indikasi produk adalah spot hitam diatas

13  Dari Gambar 1A, jelas terlihat bahwa QU663 tidak mampu menghambat aktifitas dari NS3 ATPase, meski dalam konsentrasi yang tinggi (500 µM)

14  Denaturing polyacrylamide gel electrophoretic analysis dari produk pada Helicase assay dengan kenaikan konsentrasi QU663.  Lane 7 = reaksi tanpa enzim  Lane 8 = campuran media dididihkan

15  Gambar 1B menunjukkan reaksi pada helicase assay  Terlihat bahwa QU663 menghambat aktifitas helicase dari NS3 pada konsentrasi 100 µM.

16 QU663 adalah inhibitor competitif dari NS3h dengan NA sebagai substrat  QU663 menghambat aktifitas NS3 tanpa mempengaruhi kemampuannya menghidrolisa ATP (Gambar 1)  Hepotesa yang diajukan= QU663 menghambat NS3 dalam utilisasi substrat NA, seperti ditunjukkan dalam Gambar 2 berikut:

17  Dengan penambahan substrat NA sebesar 66 nM terjadi peningkatan nilai absorbansi seiring dengan perubahan waktu (reaksi terjadi).  Namun nilai absorbansi menurun seiring dengan kenaikan konsentrasi QU663  QU663 = competitive Inhibitor

18  Laju reaksi k’ menurun seiring dengan kenaikan konsentrasi QU663

19  Plot antara laju reaksi k’ sebagai fungsi atas konsentrasi substrat (NA).  K NA =0.18 µM (- QU663/tanpa inhibitor)  K NA =0.7 µM ( µM QU663)

20  Nilai konstanta inhibitor K i dari hasil percobaan

21 QU663 tidak mengubah struktur DNA  Untuk mengetahui apakah QU663 berinteraksi dengan DNA atau tidak, dilakukan dengan 2 metoda :  Absorbansi dan electrophoretic

22  QU663 mempunyai 2 puncak absorban,  ג 1 = 314 nm dan ג 2 = 390 nm

23  Ketika QU663 dicampur pada 3 variasi DNA tidak menunjukkan percampuran/interfensi pada kedua puncak absorbansi QU663 (Gambar 3B)

24  Tidak ada perbedaan pada peta DNA ketika QU663 dicampur dengan DNA plasmid (lane 2,3,4)  Lane 1= QU663, lane M= molecular size marker

25  Gambar keseluruhan komplek QU663-NS3.  Terlihat QU663 menempel pada binding site NS3

26 Kesimpulan  QU663 adalah inhibitor competitif selektif terhadap reaksi helicase dari HCV NS3 (K i =0.75  M)  QU663 menghambat utilisasi HCV terhadap substrat NA tanpa mempengaruhi fungsi ATPase.  QU663 berpotensi untuk obat anti HCV baru.

27 TERIMA KASIH Artikel asli: Specific Targeting of Hepatitis C Virus NS3 RNA Helicase. Discovery of thePotent and Selective Competitive Nucleotide-Mimicking Inhibitor QU663† (By: Giovanni Maga,‡,§ Sandra Gemma,§,| Caterina Fattorusso,§,^ Giada A. Locatelli,‡,§ Stefania Butini,§,| Marco Persico,§,^ Gagan Kukreja,§,| Maria Pia Romano,§,| Luisa Chiasserini,§,| Luisa Savini,§,| Ettore Novellino,§,^Vito Nacci,§,| Silvio Spadari,‡,§ and Giuseppe Campiani*,§,|) Journal Biochemistry 2005, 44,


Download ppt "PENTARGETAN SPESIFIK VIRUS HEPATITIS C NS3 RNA HELICASE PENEMUAN INHIBITOR PEMIMIKAN NUKLEOTIDA QU663 YANG BERPOTENSI DAN SELEKTIF KOMPETITIF Puti Sri."

Presentasi serupa


Iklan oleh Google