Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Sejarah perkembangannya: 3000 s.M  minuman beralkohol (melalui fermentasi); namun dasar-dasar ilmiahnya baru pada abad ke-17. 1680 – Leeuwenhoek  amati.

Presentasi serupa


Presentasi berjudul: "Sejarah perkembangannya: 3000 s.M  minuman beralkohol (melalui fermentasi); namun dasar-dasar ilmiahnya baru pada abad ke-17. 1680 – Leeuwenhoek  amati."— Transcript presentasi:

1 Sejarah perkembangannya: 3000 s.M  minuman beralkohol (melalui fermentasi); namun dasar-dasar ilmiahnya baru pada abad ke – Leeuwenhoek  amati bentuk sel-sel khamir – Eryleben; mulai ketahui fermentasi oleh sel-sel khamir – Pasteur; penemuan fermentasi asam laktat – Buchner jelaskan enzim yg berperan dlm fermentasi; memahami proses fermentasi; diikuti penemuan2 lain dlm bidang mikrobiologi  mikrobiologi merupakan salah satu dasar utama perkembangan bioteknologi – Griffith; menemukan mutan bakteri Pneumococcus tipe R (non-patogenik) dpt alami transformasi  tipe S (patogenik).Pnemococcus tipe R hidup campur dg tipe S yg mati  injeksikan pd tikus  tikus mati. Isolasi darah tikus tsb.; terdpt strain tipe S yg hidup. Perubahan tipe R (hidup)  tipe S (hidup) bersifat permanen. Proses transfor- masi itu dpt dilakukan secara in vitro  ”the transforming principle” 1944 – Avery, McLeod + McCarty: the transforming principle merupakan senyawa as. nukleat tipe deoksiribose  sifat genetik ditentukan DNA – Avery & Crick : struktur 3 dimensi DNA. Nathan & Smith menemukan enzim yg dpt potong DNA secara spesifik (endonuklease restriksi); hasilkan DNA spesifik. Enzim DNA ligase mampu sambung potongan DNA an Berg gunakan enzim DNA restriksi & DNA ligase  berhasil sambung molekul DNA suatu virus  mol. DNA rekombinan.  mendpt hadiah Nobel ! Pengembangan teknologi baru yg disebut teknologi DNA rekombinan  rekayasa genetik. Para ahli mampu melakukan perubahan2 sifat genetik organisme secara ter- arah (yg diinginkan)  misalnya tanaman / organisme transgenik (GMP / GMO): Genetically Modified Plants / Genetically Modified Organisms.

2 MIKROBIOLOGI BIOLOGI MOLEKULER BIOKIMIA / KIMIA GENETIKA REKAYASA KIMIA ELEKTRONIK ILMU PANGAN REKAYASA MEKANIK TEKNOLOGI PANGAN BIOTEKNOLOGI KOMPUTER BIOTEKNOLOGI PERTANIAN BIOTEKNOLOGI INDUSTRI BIOTEKNOLOGI LINGKUNGAN BIOTEKNOLOGI KESEHATAN Ilmu dasar dan teknologi yg mendasari perkembangan bioteknologi modern serta 4 cabang utama bioteknologi. Aplikasi bioteknologi dlm bidang: PertanianKesehatanIndustriLingkungan Pengembangan tanam- an transgenik Produksi bahan tera- peutik Produksi bahan industriPenanganan limbah Kandungan provitamin A tinggi Produksi insulin gunakan mikroba Produksi beragam enzim rekombinan Ekstraksi & akumulasi logam berat Toleran thd lingkungan salinitas tinggi Prod. vaksin hepatitis B rekombinan Produksi metabolit pri- mer (mis. As. Amino) Degradasi pestisida & senyawa sejenis

3 Teknologi rekayasa genetika yg diterapkan dalam memproduksi komoditi dan pengolahan pangan merupakan suatu terobosan ilmiah yg baru, khususnya dlm meningkatkan produkti- Vitas tanaman dan ternak, meningkatkan mutu gizi, mempermudah dan mempermurah biaya produksi dan teknologi pengolahannya  timbul kontroversi. Komoditi baru yg dihasilkan mengandung gen makhluk lain  bersifat tdk alamiah  risiko jangka panjang ?? muncullah gejolak masyarakat; berupa protes dan gugatan thd diproduksinya tanaman transgenik. Perkembangan bioteknologi yg sedang terjadi saat ini : awal dari revolusi industri ketiga (revolusi industri I dlm bidang energi; revolusi industri II dlm bidang teknologi informasi). Indonesia mega biodiversity ke-2 sesudah Brazil  potensial !!! “Krismon” (1998)  perlu bangkit! Potensi Indonesia di bidang biotek (Zuhal, 2000) a.l.: 1. teknologi produksi bahan baku obat dan diagnostik harga obat & alat kesehatan naik %; karena ketergantungan bahan baku impor; baru tingkat reproduktif, blm berbasis hasil riset sendiri  prioritas aplikasi teknologi ekstraksi tanaman obat (megadiversitas !); partisipasi swasta dlm produksi antibiotika (penisilin, tetrasiklin, eritromisin). 2. Teknologi produksi pupuk hayati (biofertilizer). Subsidi pupuk dihapus  dilema petani  pupuk hayati : bakteri bintil akar (Rhizo-plus), bakteri pelarut fosfat Pseudomonas spp., dan Micrococcus; pupuk hayati kombinasi “Emas” (enhancing microbial activities in the soils) mengandung Azospirillum lipoverum, Azotobacter beijerinckii, Aeromonas punctata, dan Aspergillus niger. 3. Teknologi bioinsektisida: pemanfaatan mikroorganisme kapang dan bakteri serta virus tertentu utk mngendalikan hama dan penyakit pada tanaman  pengendalian secara biologis  ramah lingkungan.

4 K U L T U R I N V I T R O Pada awalnya : orientasi hanya pd pembuktian teori potensi sel tumbuhan  sarana penelitian di bidang fisiologi dan aspek-aspek biokimia  industri, koleksi dan konservasi plasma nutfah (dlm nitrogen cair dg suhu C), bioteknologi, dll.  - Kultur jaringan hewan - Kultur jaringan tumbuhan  sifat totipotensi Penanaman secara aseptik  - kultur cair - kultur padat Syarat yg diperlukan : - laboratorium kultur in vitro - fahami ilmu-ilmu dasar terkait; sistematika, fisiologi, kimia, fisika, mikrobiologi, sitologi, histologi, dll. - ketrampilan, ketekunan & kesabaran tinggi: persiapan media, iso- lasi bahan, sterilisasi, inokulasi, kultur, aklimatisasi, dll. Macam kultur: a) kultur organ, culture of isolated plant organs : meristem, shoot tip, bud culture, root culture, anther culture b) kultur kalus, culture of a differentiated tissue from explant allowed to dedifferntiate in vitro  callus tissue c) kultur suspensi; culture of isolated cells or very small cell aggregates re- maining dispersed in liquid medium (  shaker); inisiasi dr kalus d) kultur protoplasma: sel-sel muda yg diinisiasi dlm media cair; dihilangkan dinding sel (dg enzim)  hibridisasi somatik, fusi 2 protoplasma, intraspesifik atau interspesifik e) kultur haploid (kultur mikrospora / kultur anther f) kultur embrio: culture of isolated mature or immature embryos.

5 P E N D A H U L U A N Bioteknologi Penerapan prinsip-prinsip biologi, biokimia, dan rekayasa dlm pengolahan bahan dengan memanfaatkan jasad hidup atau / dan komponen2-nya untuk hasilkan suatu produk yg diinginkan  berkaitan dengan reaksi-reaksi biologis. Bioteknologi modern ; teknik manipulasi DNA secara in vitro; manipulasi genetik. Komponen organisme: sel, jaringan, organel, molekul-molekul tertentu (DNA, RNA, protein, enzim). Bioteknologi konvensionalBioteknologi modern 1. Relatif murah; teknologi relatif sedehana1. Relatif mahal; teknologi canggih 2. Efek jangka panjang umumnya sdh diket. karena sistemnya sudah mapan 2. Pengaruh jangka panjang belum dike- tahui 3. Perubahan sifat genetik tidak terarah3. Perbaikan sifat genetik terarah 4. Tidak dpt atasi inkompatibilitas genetik4. Dapat atasi inkompatibilitas 5. Hasil tdk dpt diperkirakan sebelumnya5. Hasil dapat diperkirakan 6. Butuh relatif lama hasilkan galur baru6. Dpt hasilkan 7 perpendek waktu 7. Butuh relatif lama hasilkan galur baru7. Perpendek waktu hasilkan galur baru dgn sifat baru yg tdk ada secara alami 8. Sering tdk dpt atasi kendala alam dalam sistem budidaya tanaman 8. Dpt tingkatkan kualitas & atasi kendala alam dlm sistem budidaya tanaman

6 Schematic representation of shoot tip culture

7 Schematic representation of vegetative propagation by single node technique.

8

9 Setiap bahan tanaman memp. tingkat kontaminasi permukaan yb berbeda, tergantung dari: - jenis tanaman & bagian tanaman yg digunakan - morfologi permukaan (mis. berbulu / tidak) - lingkungan tumbuh ( rumah kaca / lapangan) - musim waktu mengambil (musim hujan / kemarau) - umur tanaman (kecambah / tanaman dewasa) - kondisi tanaman (sakit / sehat) Sterilisasai eksplan, umum digunakan NaClO 1%, H2O2 10%, alkohol 70 %, larutan bromin 1%, HgCl 2 0,01-1% (sangat toksik !), fungisida (benlate), antibiotik 4-50 ppm (rifamisin, streptomisin, carbenisilin). Komposisi media kultur : 1) unsur hara makro dan mikro 2) sumber energi : sukrosa, glukosa 3) vitamin : thiamin (B1), piridoksin (B6) 4) ZPT / Growth regulators : auksin (sesuai tipe pertum- buhan yg dikehendaki, level auksin endogen), sitokinin (kinetin, zeatin, BAP), dan giberelin (utk membantu mor- fogenesis) Disamping golongan senyawa organik yg kandungannya jelas, dlm media kultur sering pula ditambahkan senyawa kompleks alamiah yg komposisinya dpt berbeda dari sumber yg satu dg lainnya,spt air kelapa, ekstrak ragi, ekstrak pisang, ekstrak kentang, jus tomat, dll.

10

11 Karbohidrat sbg sumber energi umumnya digunakan sukrosa, glukosa, maltosa. Sukrosa dlm media dihidrolisa jadi monosakharida karena aktifitas invertase yg terdpt pd dinding sel selama masa kultur. Hidrolisa sukrosa paling efektif dlm media dg pH rendah. Sementara itu bahan pemadat paling banyak digunakan adalah agar; keuntungannya : 1. agar membeku pd ± 45 0 C dan mencair ± C  beku stabil pd kisaran suhu kultur 2. tidak dicerna enzim tanaman 3. tidak bereaksi dg senyawa-senyawa penyusun media kultur. Kekerasan media juga dipengaruhi oleh: a. jenis agar yg dipakai; tergantung merk agar  agar Bacto mahal !!! b. pH media c. penambahan arang aktif Arang aktif adalah arang yg sdh dipanaskan bbrp jam gunakan uap atau udarapanas; sifat absorbsi sangat kuat. Arang aktif dpt ditambahkan ke dlm media pd berbagai tahap perkem- bangan kultur: media inisiasi, media regenerasi, atau media perakaran. Pengaruh arang aktif secara umum adalah: 1. mengabsorbsi senyawa-senyawa toksik yg ada dlm media yg dpt ganggu pertumbuhan kultur,. 2. mengadsorbsi ZPT sehingga cegah pertumbuhan kalus yg tdk diinginkan  ingin akar ! 3. merangsang perakaran dg kurangi tingkat cahaya sampai ke bag. Yg ada dlm media. Arang aktif ditambahkan bervariasi 0,2 - 6 % (w/v) tergtg tujuan. Hrs diusahakan agar arang aktif terbagi merata (homogen) dlm media  sesdh sterilisasi dg autoklaf  botol media se- ring dikocok sampai agar-agar mulai membeku (cegah arang tidak mengendap !)

12 Tahapan kerja pembuatan 300 ml medium kultur

13 Langkah-langkah prosedur : persiapan (media / bahan yang akan dikultur), isolasi dan pe- nanaman serta inkubasi dan penyimpanan kultur  dibutuhkan 5 ruang: - ruang persiapan - ruang transfer - ruang kultur - ruang stok - ruang analisa Teknik aseptik  lingkungan kerja, alat-alat & media, serta bahan yg akan dikultur. Media kultur dan alat paling populer disterilisasi dg cara sterilisasi uap atau sterilisasi kering. 1) steam sterilization  autoclave (suhu berkisar 115 – C) umum utk media (121 0 C, 15 psi, 20 menit); juga test tube dll. berisi 20 – 50 ml media Botol berisi 50 – 500 ml media  25 menit; 500 – 5000 ml media nutrien 35 menit. 2) dry sterilization  glassware, metallic instruments  sterilisasi 160 – C, 3 jam  bungkus aluminum foil, Autoklaf terkini memp. Program utk sterilisasi kering dan uap. Utk jumlah sedikit, bisa gunakan domestic pressure cooker (presto). 3) filter sterilization : ZPt, asam amino, vitamin  heat labile  sterilisasi dg membran filter umumnya terbuat dr selulosa asettat dan /atau selulosa nitrat. Dalam proses sterilisasi tsb. semua partikel, mikroorganisme & virus berukuran > diameter pore fil- ter akan terpisah. 4. ultra violet sterilization  iradiasi via sinar gamma; jarang digunakan utk media kultur  mahal !! Dipakai utk peralatan pre-sterilized disposable plastic wares; media yang sudah disteril (autoklaf) dituang ke dlm plastik steril tsb (pengerjaan di dlm LFC). Saat transfer didlm LFC, teknik aseptik (utk tangan) : cuci dg detergen antibakteri, lalu di- semprot alkohol 70 %; LFC juga harus disemprot alkohol 70 % sebelum digunakan.

14 Tahapan kerja sterilisasi eksplan di dalam LFC

15 Schematic representation of axillary bud method of vegetatively propagating plants. a) Rosette plants; b) elongate plants

16 Diagrammatic summary of steps involved in Berman cell planting technique.

17 Diagrammatic illustration of anther and microspores culture for production of haploid plants and diploidization

18

19 Replikasi DNA dan ekspresi genetik Replikasi DNA: salah satu tahapan penting dlm pertumbuhan organisme, proses yg awali pertumbuhan sel (pd virus, replikasi RNA; tahapan replikasinya agak berbeda). Mekanisme replikakasi dilengkapi sistem editing (penyuntingan yg sangat akurat; bahan genetik yg di- tu-runkan kpd progeny / sel anakan akan memp. komposisi yg sangat identik dg sel induk  duplikat hasil replikasi  proses kompleks; libatkan banyak protein dg peran spesifik, dikode gen-gen yg terdpt dlm DNA itu sendiri  kaitan fungsional yg amat erat tak terpisahkan antara replikasi dg ekspresi genetik dan metabolisme sel secara keseluruhan. Replikasi bahan genetik: proses pengkopian rangkaian mol. bahan genetik (DNA /RNA); pada virus replikasi bahan genetik terjadi dlm sel inang. Model replikasi DNA  3 hipotesis: 1. semi konservatif: setiap molekul untai-ganda DNA anakan terdiri dari 1 untai-tunggal DNA induk dan 1 untai-tunggal DNA hasil sintesis baru. 2. konservatif: molekul DNA untai-ganda induk akan tetap bergabung sedangkan kedua untaian DNA anakan terdiri dari molekul hasil sintesis baru. 3. dispersif: molekul DNA induk akan mengalami fragmentasii  DNA anakan akan terdiri dari campuran molekul lama (berasal dari DNA induk) dan molekul hasil sintesis baru. Messelon & Stahl (1958) buktikan bhw replikasi DNA  semi konservatif Escheria coli). tapi pd virus tertentu dg genom berupa DNA untai-tunggal Mekanisme dasar replikasi DNA Semi konservatif  DNA anakan: pasangan untaian DNA induk & untaian DNA hasil sin- tesis baru  untaian DNA induk berperan sbg cetakan / templatebagi pembentukan untaian baru. Molekul untai ganda terdiri dai 2 untai mol.DNA yg berpasangan secara komplementer: antara basa nukleotida A-T dan C-G, perlu pemutusan/denaturasi ikatan komplementer tsb,

20  masing-masing untaian DNA dpt bertindak sbg cetakan setelah denaturasi (enzimatis). Denaturasi secara parsial & bertahap, diwali pd ori (origin of replication/ttk awal replikasi)  ikatan H antara A-T dan C-G terputus diikuti pembukaan untaian DNA  garpu replikasi membuka bertahap  terpisah satu sama lain; masing-masing sbg cetakan utk penempel- an nukleotida-nukleotida penyusun DNA baru, yg dipolemerisasi jadi untaian DNA baru, urutan sesuai urutan cetakan DNA komplementernya (basa nukleotida A akan dipasangkan dg T yg ada pd cetakannya, basa C dg G. Untaian DNA yg baru terbtk merupakan komple- men untaian DNA induk. Proses polimerisasi nukleotida terjadi pd kedua untaian DNA ce- takan  akhir 1x putaran replikasi dihasilkan 2 mol. DNA baru yg identik  dst. Berulang. Komponen-komponen penting dlm replikasi a) DNA cetakan: mol.DNA atau RNA yg akan direplikasi. b) mol. nukleotida: dATP, dTTP, dCTP, & dGTP (3 komponen nukleotida: basa purin atau pirimidin, deoksiribosa, dan gugus fosfat). c) DNA polimerase, mengkatalisis polimerisasi nukleotida  untaian DNA. d) Primase, mengkatalisis sintesis primer utk memulai replikasi (pd E. coli disbt primosom) e) helikase, enzim pembuka ikatan untaian DNA induk, dibantu enzim girase. f) SSB (sngle strand binding protein), menstabilkan untaian DNA yg sudah terbuka. g) DNA ligase, enzim penyambung fragmen-fragmen DNA. Tahapan dlm replikasi DNA: a) denaturasi (pemisahan) untaian DNA induk b) inisiasi sintesis DNA c) pemanjangan untaian DNA d) ligasi fragmen-fragmen DNA e) pwng”akhir”an ( termination) sintesis DNA

21 Kedua untaian induk DNA terpisah (enzim helikase)  garpu replikasi sbg cetakan utk sintesis DNA baru membuka bertahap dari ori orientasi 5‘ -P  3' –OH  arah geometris berlawanan Sintesis: - searah pembukaan garpu replikasi (kontinu)  untaian DNA awal / leading strand  DNA baru merupakan 1 unit. - berlawanan arah dg pembukaan garpu replikasi (sintesis diskontinu)  untaian DNA lambat; polimerisasi fragmen demi fragmen (fragmen Okazaki)  disambung enzim DNA ligase  unit utuh. Utk memulai replikasi DNA dibutuhkan: - molekul primer, utk awali proses polimerisasi untaianDNA: DNA, RNA, atau mol.protein spesifik; proses polimerisasi untaian RNA (transkripsi) tdk memerlukan primer  fungsi primer: sediakan ujung 3'-OH utk tempelkan mol.DNA pertama dlm proses tsb. - cetakan / template : untaian DNA atau RNA Setelah nempel pd cetakan  sintesis DNA baru. Pd sintesis untaian DNA lambat, perlu >1 primer krn sintesis DNA berlawanan dg arah pembukaan garpu (sintesis diskontinu). Sumber energi utk aktivitas DNA ligase didpt dari NAD atau ATP. Pd sintesis untaian DNA awal, arah sintesis searah pembukaan garpureplikkasi  berlang- sung kontinu  hanya perlu 1 mol. primer yaitu pd ttk awal replikasi. Untaian DNA baru akan disintesis dg adanya aktivitas DNA polimerase III tanpa pembtkan fragmen Okazaki. Pd E. coli: - DNA polimerase I mengisi celah antara fragmen Okazaki & reparasi DNA rusak - DNA polimerase II juga terlibat dlm reparasi DNA rusak - DNA polimerase III, proses polimerisasi primer

22 Ekspresi genetik Dlm genom organisme terdpt rangkaian gen, susun genotip organisme itu  diekspresikan dlm bentuk fenotipe: - kemampuan hasilkan metabolit tertentu - kemampuan thd hama / penyakit - toleransi thd faktor lingkungan tertentu - rasa buah, btk & warna daun, batang, dll. Ekspresi genetik dilakukan melalui proses transkripsi gen-gen tertentu menjadi RNA (mRNA, rRNA, tRNA); selanjutnya mRNA alami translasi  protein / enzim. Transkripsi: proses penyalinan kode-kode genetik pd urutan DNA  mol.RNA; proses ini mengawali ekspresi sifat2 genetik (ciri fenotipe). Translasi: memerlukan mol. rRNA utk susun ribosom; dan tRNA bawa as. amino spesifik yg akan dirangkai  mol. protein. Transkripsi dan translasi: 2 proses berbeda yg saling berkaitan erat & sangat me- nentukan kemampuan organisme utk tumbuh & berkembang. Proses transkripsi dilakukan RNA polimerase; pd prokariota hanya ada 1 macam RNA polimerase; pd eukariota ada 3: - RNA polimerase I, menyalin gen yg mengkode rRNA - RNA polimerase II, menyalin semua gen pengkode protein - RNA polimerase III, menyalin gen yg mengkode tRNA Pemunculan fenotipe ditentukan tiga macam molekul RNA tsb. Proses transkripsi melibatkan bbrp komponen utama yaitu: - urutan DNA yg akan ditranskripsi - enzim RNA polimerase - faktor-faktor transkripsi - prekursor utk sintesis RNA

23 Urutan DNA yg akan ditranskripsi adalah gen yg akan diekspresikan; gen merupakan suatu urutan DNA yg mengkode urutan lengkap as.amino suatu polipeptida atau mol.RNA tertentu. Gen yg lengkap terdiri dari 3 bag.utama: - promoter, daerah pengendali / regulatory region transkripsi, terletak pd ujung 5' - bag. struktural, dihilir/downstream promoter; mengandung urutan DNA spesifik (kode-kode genetik) yg akan ditranskripsi. - terminator; di hilir bag. struktural; peran dlm peng”akhir”an (terminasi) proses transkripsi. Mekanisme dasar sintesis RNA (transkripsi) prokariota & eukariota: - prekursor utk sintesis RNA: 4 macam ribonukleotida yaitu 5‘-trifosfat ATP, GTP, CTP, dan UTP (pd RNA tdk ada thymine) - reaksi polimerisasi RNA pd prinsipnya = polimerisasi DNA, yaitu dg arah 5'  3'. - urutan nukleotida RNA hasil sintesisditentukan oleh cetakannya yaitu urutan DNA yg di- transkripsi; nukleotida RNA yg digabungkan : yg komplementer dg cetakannya. - mol. DNA yg ditranskripsi adalah mol.untai-ganda, tetapi yg berperan sbg cetakan hanya salah satu untaiannya. Perbedaan struktural sel prokariota & eukariota  beda struktur gen, faktor pengendali, meka- nisme & sistem regulasi. Pd prokariota, seblm transkripsi selesai dilakukan, sdh diikuti proses translasi. Pd eukariota, proses transkripsi terjadi di dlm nukleus; translasi pd sitoplasma  translasi baru dilaksanakan bila proses transkripsi sudah selesai. Organisasi gen pd prokariota Umumnya gen yg mengkode protein pd prokariota: gen dg kopi tnggal / single copy, gen yg mengkode tRNA & cRNA gen dg jumlah kopi banyak / multiple copies.Gen-gen yg bertang- gung jawab dlm jalur biokimia tertentu umumnya diorganisasikan dlm btk operon (organisasi bbrp gen struktural yg ekspresinya dikontrol 1 promoter yg sama)  mis. operon lac.

24 Operon lac (kendalikan potensi metabolisme laktosa pd E. coli)terdpt 3 macam gen struktural yg kode protein berbeda: - gen Z, mengkode β-galaktosidase - gen Y, mengkode permease - gen A mengkode trans-asetilase masing-masing memp. kodon inisiasi/awal & kodon terminasi, tapi ekspresinya dikontrol oleh 1 promoter yg sama  transkripsi akan hasilkan 1 mRNA yg bawa kode-kode genetik bagi ketiga macam polipeptida tsb (  disebut mRNA polisistronik). Organisasi gen pd eukariota Pd eukariota, ekspresi 1 gen struktural yg kode suatu protein dikontrol 1 promoter spesifik  yg dihasilkan : mRNA monosistronik ( utk 1 macam protein saja). Konsep Beadle & Tatum (1941): teori satu gen – satu enzim; tapi banyak protein / enzim yg mol. Lengkap semua polipeptidanya dpt dikode oleh >1 gen struktural.(mis. mol.hemoglobin dikode oleh 2 gen)  sekarang dikenal teori satu gen – satu polipeptida. Seringkali pd banyak gen eukariota terdpt urutan2 nukleotida (kodon) yg tdk diketemukan terjemahnnya dlm urutan as.amino (intron / intervening sequencs); pd awalnyaditranskripsi, tapi selanjutnya mengalami pemotongan  transkrip mRNA tdk mengandung urutan tsb; bag. yg hilang dari mRNA itu tdk akan ditranslasi jadi urutan as.amino.Sebaliknya, bag. gen struk- tural yg ditranskripsi jadi mRNA dan lalu ditranslasi disebut exon. Setelah pemotongan intron, exon-exon disambung (splicing)  mRNA (tanpa intron), translasi jadi urutan asam2 amino. Translasi (hanya mRNA yg ditranslasi !); berlangsung dlm ribosom; diperlukan mol.tRNA utk bawa as.amino spesifik (ada 20 macam tRNA;  20 macam as.amino yg susun protein alami) Transposisi: suatu proses perpindahan elemen genetik dari 1 lokus dlm 1 kromosom, plasmid, atau genom virus, ke bag. lain kromosom yg sama, atau ke suatu lokus kromosom lainnya.

25 Transposisi: suatu proses perpindahan elemen genetik dari 1 lokus dlm 1 kromosom, plasmid, atau genom virus, ke bag. lain kromosom yg sama, atau ke suatu lokus kromosom lainnya. Elemen genetik yg berpindah mungkin 1 atau beberapa gen yg bertaut (linkage)  elemen genetik yg dpt berpindah (transposablegenetic elements) atau transposon  prokariota, eukariota, maupun bakteriofag. Dlm prokariota (E. coli) diketahui 3 kelompok transposon: 1. sekuen penyisip / insertion sequences; suatu urutan nukleotida yg hanya berfungsi utk transposisi sekuen saja  transposon paling sederhana. 2. elemen penyisip / insertion elements; ntransposon yg berfungsi transposisi dan memba- wa gen lain; mis. Gen ketahanan thd antibiotik; disebut juga transposon komposit. 3. bakteriofag Mu; bakteiofag lisogenik yg gunakan proses transposisi sbg cara hidupnya. Transposon dlm eukariota: 1. elemen Ty dlm khamir  Saccharomyces cerevisiae 2. elemen copia pd Drosophila; ada juga copia-like element (± 5-10% genom Drosophila mengandung 40 familia transposon; mirip elemen komposit. Mekanisme transposisi belum jelas. Pada E. coli, transposisi terjadi melalui: 1. cara replikatif  dibtk duplikat transposon  akhir transposisi dihasilkan 1 duplikat transposon pd tempat yg baru dan satu pd tempat lama. 2. cara konservatif  tdk ada replikasi; hanya pemotongan elemen transposon  diin- tegrasikan ke tempat baru.

26 BIOTEKNOLOGI MIKROBA Mikroba : - eukariot  Saccharomyces cerevisiae - prokariota  - Eubacteria - Archaea  Berbagai produk gunakan mikroba: utk dikonsumsi, pupuk / pestida hayati, farmasi, dll. Prinsip dasar kultivasi, digunakan: - medium padat / solid medium  tempe, oncom - medium cair / liquid medium  antibiotik, asam-asam amino Berdasarkan komposisi medium: - medium lengkap: bahan organik, ekstrak bahan alamiah (khamir, daging) + bahan anorganik  mikroba tumbuh optimal - medium minimal defined medium: bahan kimia sintetis  pertumbuhan minimal; lebih ke arah analisis fisiologis / genetika yg butuh komposisi nutrisi spesifik (utk hasilkan produk tertentu). Dalam industri bioteknologi, medium lengkap sering + komponen tambahan  berpengaruh signifikan thd jumlah produk  + biotin utk memacu produksi antibiotik atau as.amino. Teknik kultivasi mikroba: 1) Kultur batch (sekali panen)  mikroba ditumbuhkan dlm medium  pertumb. maksimal  panen produknya (sel/biomassa atau produk metabolitnya)  kultivasi awal lagi. Pola pertumb. mikroba dlm kultur batch: - fase lag /adaptasi, tergtg: status fisiologis, macam mikroba, kondisi medium seblmnya - fase eksponensial / logaritmik; pertumb. dipercepat / accelerated growth phase - fase pertumb. diperlambat / deccelerating growth phase - fase stasioner, ratio yg tumbuh dan mati seimbang  jumlah sel secara total tetap  pertumb.diteruskan  fase kematian, jumlah sel total menurun  pemanenan saat fase eksponensial / stasioner (krn terjadinya sintesis metabolit sekunder).

27 2) Kultur kontinyu; mikroba ditumbuhkan secara terus menerus pd fase paling optimum fase pertumbuhan (fase eksponensial)  beri nutrien terus menerus secara kemostat (melalui tanki)  komposisi nutrien dlm fermentor tetap (atur aliran medium baru) atau turbidostat, penambahan nutrien secara kontinyu  kerapatan sel (turbiditas kultur) selalu dlm keada- an tetap. Aliran medium diatur berdasarkan kerapatan optik kultur media. Bila produk metabolit berpengaruh negatif thd pertumbuhan mikroba (protein rekombinan, yg gen-nya dari jasad lain)  gunakan kultur batch. Bila produksi metabolit sel tdk berpengaruh thd pertumbuhan selnya  gunakan kultur kontinyu (mis. produksi protein / enzim homolog, protein yg disintesis berdasarkan hasil ekspresi gen alami yg dimiliki jasad tsb.  skala besar. Mikroba juga dpt dimanfaatkan hasilkan produk tertentu dg gunakan medium padat/semipadat  tempe, tape, jamur merang, dll. Pemanfaatan dlm bioteknologi  teknologi DNA rekombinan  punya kemampuan fisiolo- gis yg tdk didpt di alam  bakteri / khamir hasilkan protein yg secara alami hanya dihasilkan jasad tingkat tinggi; mis. Insulin, hormon pertumbuhanl. Bbrp produksi yg dimaksud meliputi: 1) produksi pangan yg dikonsumsi langsung 2) produksi bahan bakuutk pangan 3) produksi utk dukung tahapan seblmpanen (pre-harvest materials) 4) produksi bahan-bahan utk pengelolaan kesehatan 5) produksi bahan-bahan pendukung industri yg lain Mikroba digunakan sbg.: - agensia produksi; kemampuan mikroba dimanfaatkan utk lakukan perubahan (biotransformasi) suatu bahan yg diinginkan  pd tahap akhir, sel mikroba dipisah, produk biotransformasi dipanen. - produk hasil akhir; sel mikroba itu yg dipanen & dimanfaatkan

28 a)Agensia produk akhir; meliputi: - produk minuman / beverages: bir, wine  khamir - produk pangan: starter dlm industri keju: Streptococcus, Lactobacillus - asam-asam amino: L-asam glutamat, phenilalanin, lisin, triptophan - asam-asam organik: as.fumarat, sitrat, laktat, piruvat Terkadang agensia produksi sekaligus sbg produk akhir  Industri susu fermentasi. Protein yg gennya berasal dari organisme tingkat tinggi (mis.insulin), dg gunakan mikrob rekombinan  ekonomis (alami: dari pankreas sapi / babi)  mahal ! b) Produk akhir: - dikonsumsi langsung bersama substrat: tempe, tape, protein sel tunggal / single cell protein, (susu + mikroba  berguna utk pencernaan). Mikroba juga dimanfaatkan pd tahapan seblm panen / pre-harvest (utk pupuk / pestisi- da hayati) kerapatan sel tertentu  dipanen; kemas dlm carrier tertentu mis. tanah gambut. Biasanya campuran bbrp jenis mikroba atau strain berbeda. Peningkatan kemampuan fisiologis mikroba  2 metoda : konvensional & modern (  tek- nik mutagenesis, dg mutagen kimia atau mutagen fisik; dan fusi prtoplasma). 1) mutagenesis dg mutagen kimia: ubah karakter mikroba dg ubah urutan nukleotida suatu gen, meskipun tdk dpt diarahkan secara spesifik  acak. Agensia kimia yg digunakan: a) analog basa dan b) mutagen kimia Analog basa: senyawa yg memp.struktur kimia mirip dg salah satu basa nukleotida  dpt digabungkan dg mol.DNA dlm proses replikasi. Mutagen kimia adalah senyawa yg dpt ubah suatu basa nukleotida didlm untaian DNA hingga spesifisitas ikatan hidrogennya berubah, Mutagen itu sendiri tdk akan tergabungkan ke dlm struktur DNA; mis. HNO 2, hidroksilamin (HA), etilmetan sulfonat (EMS), dan nitroso guanidin (NG); senyawa peng- interkalasi (proflavin, ethidium bromide)  mampu menyisip/interkalasi di antara pa- sangan basa nukleotida saat DNA direplikasi.

29 2) Mutagenesis dg mutagen fisik  sinar ultraviolet dan radiasi ionisasi  distorsi pd struk- tur DNA  hambat proses replikasi DNA  replikasi tdk sempurna  komposisi genetik berbeda dari induknya. 3) Mutagenesis secara terarah (Site-directed mutagenesis). Melibatkan teknik kloning DNA: a) klon fragmen DNA yg akan dimutasi ke dlm suatu plasmid  manipulasi thd fragmen tsb dg delesi; pemotongan dilakukan enzim restriksi tertentu  ligasi kembali’ b) sisipkan bbrp nukleotida baru. Fragmen DNA dipotong dg enzim restriksi yg hasilkan ujung kohesif (mis. EcoRI)  perlakuan reparasi DNA secara enzimatis (mis.T4 DNA polimerase)  dihasilkan ujung-ujung fragmen DNA yg pepat (blunt-end) yg mengan- dung tambahan bbrp nukleotida baru  ligasi kembali  akhirnya diperoleh fragmen DNA baru yg mengandung sisipan nukleotida baru. c) diarahkan oleh oligonukleotida tertentu (oligonucleotide-directed mutagenesisi); me- rupakan metode paling spesifik; dpt digunakan utk ubah 1 basa tunggal. Fragmen DNA yg akan dimutasi diklon kedlm vektor DNA untai-tunggal. Digunakan oligonuk- leotida tertentuu (panjang 7-20 nukleotida) yg komplementerdg bag,tertentu fragmen DNA yg akan dimutasi. Oligonukleotida itu dirancang memp.1 basa yg tdk dpt berpa- sangan dg basa yg ada pd lpd fragmen DNA, yaitu basa yg akan dimutasi  campur dg DNA vektor  terjadi hibridisasi oligonukleotida pd bag.yg kpmplementer  sin- tesis DNA dg gunakan oligonukleotida yg dihibridisasikan tsb sbg primer. Hasil sinte- sis berupa mol.DNA untai-ganda  transfeksi kedlmsel inang yg sesuai (E. coli)  didpt 2 hasil; koloni yg bawa mol.DNA tipe alami & yg bawa DNA mutan  isolasi kedua DNA  hibridisasi dg oligonukleotida pelacak (probe) yg mengandung basa mutan yg sdh dilabel senyawa radioaktif yg hanya akan berhibridisasi dg mol.DNA mutan  dpt ditentukan koloni yg bawa fragmen gen mutasi. Utk konfirmasi  laku- kan sekuensing DNA dari DNA isolasi yg diduga bawa gen mutan.

30 Bbrp gen mamalia dan virus yg sdh diekspresikan pd bakteri utk keperluan medis: Protein Fungsi interferon agensia antivirus insulin terapi diabetes hormon tumbuh terapi abnormalitas pertumbuhan hormon parathyroid regulasi kalsium virus manusia (hepatitisB, influenza, AIDS) vaksin virus hewan (penyakit mulut dan kuku) vaksin serum albumin aplikasi transfusi Bbrp antibiotik yg dihasilkan mikroba Antibiotik Mikroba terkait penisilin Pennicillium chrysogenum erythromycin Streptomyces erythreus kanamycin Streptomyces kanamyceticus streptomycin Streptomyces griseus tetracyclin Streptomyces rimosus Bbrp vitamin dan asam amino yg dihasilkan mikroba Metabolit Bahan pangan Kegunaan Mikroba terkait glutamat (MSG) berbagai produk penyedap rasa Brevibacterium thiogenetalis lysine roti as.amino esensial B. flavum tryptophan berbagai produk suplemen makanan, Corynebacterium komponen transfusi glutamicum

31 BIOTEKNOLOGI PUPUK HAYATI Pupuk buatan : artificial chemicall fertilizer; urea, TSP dll.,butuh energi banyak; dampak lingkungan. Pupuk hayati / biofertilizer; inokulan mikroba  alami; ramah lingkungan; penambat nitrogen; pelarut fosfat. N2 udara, melalui rangkaian reaksi diazotrofi (penambatan nitrogen secara biologis)  senyawa nitrogen yg siap diab- sorb tanaman. Fiksasi N: 1) secara non-simbiotis  free-living microbes: kelompok bakteri & alga biru hijau. Bakteri penambat N secara non-simbiotis dapat bersifat: - aerob : Azotobacter, Azospirillum, Derxia, Mycobacterium, Azomonas. - anaerob: Clostridium, Desulfovibrio, Chlorobium, Chromatium - fakultatif anaerob: Rhodopseudomonas, Bacillus, Enterobacter. Dari kelompok sianobakteria: Anabaena, Anabaenopsis, Lyngbya, Oscillatoria, Nostoc, Calothrix, Plectonema, Stegonema. Azotobacter; heterotrofik (energi dari sisa-sisa tanaman)  banyak dipelajari. sifatnya: - laju respirasi paling tinggi - sifat mesofilik, tumbuh pd suhu sekitar 30 o C - kerapatan di dlm tanah 10 3 – 10 6 sel / g tanah A. paspali diestimasi memp. kemampuan sumbang kg N/ha/thn pd dae- rah perakaran Paspalum notatum. Beijerinckia (di tanah masam tropis) mampu hasilkan 50 kg N/ha/thn pd perakaran tanaman tebu. Derxia (pd pH 5,0 – 9,0). Dlm kondisi tergenamg, Clostridium acetobutylicum dan C. pasteurianum, jum- lah meningkat 10 2  10 6 sel/g tanah. Sianobakteri umum di daerah penanaman padi __> membtk heterokist / tidak

32  fiksasi N, dan juga sekresikan vit.B12, auksin, & as. askorbat  utk pertumb. tanaman. Fiksasi N secara non-simbiotis: N 2 (oleh nitrogenase)  NH 3. Kompleks nitrogenase ter- susun atas 2 metalloprotein: - protein molybdo-ferro (protein Mo-Fe); peran sbg nitrogenase - protein ferro (protein Fe), peran sbg nitrogenase reduktase  dinon-aktifkan oleh keberadaan oksigen (sifat mutlak anaerob!). Pd sianobakteri: - fiksasi N dlm hetercyst; ddgnya mengandung seny.glikolipid yg dpt menambat O 2  suasana anaerob. - tanpa hetercyst (Lyngbya, Oscillatoria)  fiksasai N dlm sel yg terkondisi tereduksi. Pd mikroba non-simbiotik; proses fiksasi N dilakukan dg adanya laju respirasi yg tinggi  O 2 tdk dpt capai kompleks nitrogenase. 2) secara simbiotis Bbrp mikroba lakukan penambatan N melalui hub. simbiotik dg tan.tertentu  struktur khusus pd tanaman  hub.simbiotik Rhizobium dg tanaman legum. Rhizobium: bakteri Gram negatif, bersifat aerob, tdk membtk spora, btk batang dg ukuran (0,5 – 0,9) x (1,2 – 3) µm; terdpt dlm daerah perakaran, simbiosis dg tan.legum khusus.  4 kelompok bakteri pembtk bintil akar: - Genus I: Rhizobium; tumbuh cepat/fast growing bacteria: R. leguminosorum, R.meliloti - Genus II: Bradyrhizobium; tumbuh lambat/slow growing bacteria: B. japonicum. - Genus III: Sinorhizobium; tumbuh lebih cepat: Rhizobium fredii; simbiosis dg kedelai. - Genus IV: Azorhizobium; membtk bintil batang pd Sesbania: A. caulinodans. Frankia (Actinomycetes) simbiosis dg Alnus, Myrica, Casuarina membtk bintil akar tipe corra- loid (bercabang-cabang) & tipe Casuarina, apeks bintil akar membtk akar geotropik.

33 Simbiosis Rhizobium - legum dicirikan pembtkan bintil akar pd tan.legum (inang) diawali dg sekresi produk metabolisme tan. ke daerah perakaran  stimulasi pertumbuhan bakteri; tdk hanya Rhizobium.Tahapan pembtkan bintil akar umumnya: 1) Pengenalan pasangan yg sesuai antara tanaman-bakteri  pelekatan bakteri Rhizobium pd permukaan rambut akkar tanaman. 2) Invasi bakteri ke dlm rambut akar melalui pembtkan benang infeksi / infection thread. 3) Perjalanan bakteri ke akar utama melalui benang infeksi. 4) Pembtkan sel-sel bakteri yg alami deformasi (bakteroid), di dlm sel akar tanaman. 5) Pembelahan sel tanaman dan bakteri  terbtk bintil akar. Pelekatan Rhizobium pd rambut akar dpt terjadi karena pd permukaan bakteri itu terdpt suatu protein pelekat: rhicadhesin (protein pengikat kalsium yg berfungsi dlm pengikatan kompleks Ca pd permukaan akar) dan lectin / phytoagglutinin (protein berkarbohidrat, berperan dlm pengikatan bakteri. Penetrasi awal ke rambut akar dilakukan melalui ujung rambut akar  rambut akar meng- gulung akibat sekresi bakteri (seny.faktor Nod)  masuk rambut akar  induksi pembtkan be- nang infeksi (tabung selulosa)  bakteri dlm benang infeksi tumbuh ke arah sel-sel akar  faktor Nod (dihasilkan bakteri) stimulasi pembelahan sel-sel tanaman  bintil akar. Selanjut- nya bakteri tumbuh cepat dan alami perubahan bentuk jadi bakteroid (struktur bercabang), di- kelilingi peribakteroid (membran sel tanaman)  barulah terjadi penambatan nitrogen. Tanaman mati  bintil akar rusak, bakteri terlepas keluar sel akar; bakteroid tdk mampu membelah lagi; sebagian dorman (yg bukan bakteroid)  dpt infeksi akar legum lagi. Selama pembtkan bintil akar, banyak gen tanaman & Rhizobium yg diekspresikan secara berurutan. Tahap tertentu  nodulin (hasil ekspresi gen tanaman); a) protein yg jaga struktur bintil akar; b) protein yg dukung fungsi bakteroid (fiksasi N), dan c) protein/enzim yg diekspresikan selama proses metabolisme dan asimilasi nitrogen.

34 Perkembangan bintil akar dipengaruhi bbrp faktor: 1) konsentrasi nutrien anorganik 2) suhu tanah (25 – 30 0 C utk pembtkan bintil optimum, > /< akan terhambat) 3) cahaya & naungan (cahaya: tingkatkan jumlah bintil; naungan: menurunkan) 4) konsentrasi CO 2 (konsentrasi tinggi  tingkatkan jumlah bintil akar) 5) ketersediaan N dlm tanah (tinggi  kurangi jumlah dan berat bintil akar) 6) keberadaan mikroorganisme lain di dlm rhizosfer. Mekanisme penambatan N di dlm bintil akar Bintil akar legum merah (pigmen leghaemoglobin (LHb) yg mengandung Fe; ≈ myoglo- bin pd hewan.; hanya pd akar sehat. Yg tdk sehat, bintil akar putih  tdk bisa fiksasi N. LHb berada di luar membran bakteroid, berfungsi atur konsentrasi oksigen krn bakteroid bersifat aerob. Fiksasi N sangat peka thd keberadaan oksigen (> 0,5 atm hambat fiksasiN krn terja- di pe-nonaktif-an kompleks nitrogenase. Dalam hal ini,LHb berfungsi sbg: - fasilitator pengambilan oksigen oleh enzim oksidase terminal dan tingkatkan produksi ATP utk aktivitas nitrogenase. - pencipta suasana anaerob di sekitar nitrogenase (gabung dg oksigen  oxyhaemoglo- bin (OLHb) hingga O 2 tersedia di permukaan membran sel bakteri  OLHb bantu pro- ses respirasi bakteri & sediakan ATP utk tambat N sekaligus lindungi kompleks nitroge- nase dari pengaruh oksigen. Dlm proses penambatan nitrogen: - nitrogenase reduktase (protein Fe) berinteraksi dg ATP dan Mg ++ - nitrogenase (protein Mo-Fe) mengkatalisis reduksi N 2, H +, asetilen  > NH 3, H 2, etilen. Selama fiksasi N, sumber reduktan utk transfer elektron berasal dr ferredoxin / flavodoxin yg tereduksi  berikan elektron ke protein Fe hingga reduksi protein Mo-Fe, diikuti pelepas- an P anorganik; kompleks nitrogenase peroleh energi dari ATP hasil respirasi  protein Mo-Fe berikan elektron ke substrat yg dpt direduksi, misalnya N 2.

35 Secara umum reaksi fiksasi N pd bintil akar: N ATP + 8e H + 2 NH4 + + H ADP + 16P i Mg ++ Amonia adalah produk stabil I pd proses fiksasi N  ditransfer melalui membran bakteroid ke del tanaman  digunakan dlm metabolisme tanaman. Sianobakteri yg membentuk asosiasi simbiotik, yg memp. Heterocyst yaitu Anabaena azo- llae bersimbiosis dg Azolla (Pteridophyta). Anabaena berasosiai dg rambut multiselular dlm rongga khusus daun Azolla; berperan dlm transfer N dari mikrosimbion dan tan.inangnya. Pe- nambatan N terjadi dlm heterocyst. Azolla banyak digunakan sbg pupuk hijau pd petanaman padi.A. filiculioides mampu tumbuh lebih cepat; 50 hari dpt hasilkan biomassa 1700 kg b.k./ha  yg mengandung nitrogen ≈ 52 kg N/ha. Azolla mudah terkomposisi menjadi ammonia  potensi sediakan unsur N yg dibutuhkan tanaman padi. Mikroba pelarut fosfat  mampu lakukan pelarutan (solubilization) fosfat dari sumber fos- fat (batuan fosfat); bakteri ( Pseudomonas, Bacillus) dan jamur (Penicillium, Aspergillus). Ke- mampuan larutkan fosfat krn sekresikan as.organik format, asetat, propionat, laktat, glikolat, fumarat, dan suksinat  pH tanah turun  fosfat larut  as. hidroksi meng-chelate Ca & Fe  pelarutan dan penggunaan fosfat lebih efektif. Ca 3 (PO 4 ) 2  H 2 (PO 4 ) - dan H(PO4) = sbg hara P yg tersedia bagi tanaman. Jumlah fosfat terlarut yg dihasilkan mikroba heterotrof ber- Variasi dg banyaknya karbohidrat yg dioksidasi; dan transformasi itu umumnya terjadi bila substrat berkarbon diubah jadi as,organik. As.nitrat & sulfat yg dihasilkan dlm oksidasi bahan nitrogen atau seny,anorganik sulfur bereaksi dg batuan fosfat hingga tingkatkan jumlah fosfat terlarut.

36 Teknik dasar pembuatan pupuk hayati  dibutuhkan 4 komponen: a) mikroba yg sesuai utk suatu jenis pupuk hayati  bila > 1 mikroba, hati-hati ! b) medium utk perbanyakan sel mikroba yg akan digunakan c) bahan pembawa / carriermikroba d) bahan pengemas / packaging materials Bila > 1 mikroba (beda strain, spesies, atau genus)  lakukan uji antagonistik !  setiap macam mikroba kultur dulu terpisah dlm medium yg paling sesuai sebelum dikemas. Secara umum, tahap produksi inokulan mencakup: 1) isolasi dan skrining mikroba yg akan digunakan sbg pupuk 2) perbanyakan mikroba dlm medium yg tepat 3) pencampuran dg bahan pembawa / carrier; 4) pengemasan Idealnya, mikroba diisolasi dari habitat lokal  adaptasi mudah pd lingkungan tem- pat aplikasi. Menurut Keyer dkk. (1993) inokulan Rhizobium tsb. sebaiknya: 1) mampu membtk bintil akar & menambat N pd tan. legum targetnya 2) mampu infeksi & membtk bintil akar meskipun ada rhizobial pesaing 3) mampu menambat N dlm kisaran kondisi lingkungan yg luas 4) mampu btk bintikl akar& menambat N meski ada N di dlm rtanah 5) tumbuh baik dlm medium perbanyakan, dlm carrier, dan dlm tanah 6) persisten di dlm tanah;, khususnya utk kepeluan penanaman kembali 7) mampu bermigrasi dari ttk awal inokulasi 8) mampu mengkolonisasi tanah tanpa ada pengaruh akar tan.inang 9) toleran thd cekaman lingkungan 10) mampu dukung fiksasi N dlm asosiasinya dg kisaran kultivar tan. yg luas 11) sesuai / kompatibel dg bahan kimia yg digunakan dlm pertanian

37 Medium kultur utk Rhizobium  YEMA ( Yeast Extract Manitol Agar); perlu subkultur ! Komposisi YEMA (manitol bisa diganti sukrosa atau glukosa): Komponen Berat /L (g) K 2 HPO 4 0,5 MgSO 4 0,2 NaCl 0,1 Manitol* 10,0 Yeast extract 1,0 Akuades 1000 Agar 20 Perbanyakan dilakukan dlm fermentor besar dilengkapi alat atur pH, oksigen terlarut, suhu dan penggojlok; atau tabung erlenmeyer dg shaker yg diatur kecepatannya. Carrier yg digunakan dlm pembuatan pupuk hayati sebaiknya bersifat: 1) memp. Kkemampuan tinggi dlm menahan air 2) tdk toksik bagi mikroba 3) mendukung pertumbuhan mikroba 4) secara umum steril atau sdh disterilkan 5) bahan mudah diperoleh dg harga murah 6) mep.daya lekat thd benih 7) memp. Komposisi seragam secara kimia 8) mudah diatur pH-nya 9) mudah didegradasi, tidak mencemari lingkungan 10) mudah melepaskan mikroba bila digunakan di tanah 11) mudah dicampur dan dikemas

38 Gambut ideal sbg carrier; dpt pula digunakan lignite, arang, vermiculite, zeolite, dll. Biasa- nya ditambahkan pula bahan lain spt kapur dan lempung, utk atur pH, peroleh tekstur bahan Inokulan yg baik dan mudah dikemas serta digunakan  kemas dlm kantong kuat tapi lentur tdk mudah sobek atau bocor  aluminum foil. Inokulan dicampur benih yg akan ditanam, bi- asanya dipakai 4-6 g inokulan/kg benih. Produksi inokulan Azotobacter Kemampuan fiksasi N Azotobacter 2-15 mgN/gsumber karbon yg digunakan, sifat hidup bebas, inang tdk spesifik; juga mampu hasilkan metabolit lain yg bermanfaat bagi pertum- buhan tanaman spt,: auksin, thiamin, riboflavin, pyridoxin, as.nikotianat, giberelin, dll. Juga hasilkan antibiotik anti jamur  baik utk perkecambahan. Prinsip dasar produksinya = Rhizobium. Perbanyakan dpt dilakukan dg medium cair dlm fermentor atau dg tabung erlenmeyer. Bahan pembawa dibuat bubuk dulu, dinetralkan dg CaCO 3 dan dicampur dg kultur cair, baru dikemas  inokulan berbtk bubur  benih dicam- purkan  keringkan dlm kondisi teduh  tanam. Bila sistem penanaman melalui benih  celupkan akar bibit ke dlm bubur inokulan selama menit sebelum ditanam. Dlm skala kecil  kultur medium agar  kerok dari agar  suspensikan dlm akuades steril  lang- sung gunakan sbg inokulum. Sianobakteri / blue green algae sbg pupuk hayati Sifat fotosintetik dan mampu fiksasi N; Anabaena, Anabaenopsis, Nostoc, Stigonema, dll. Juga sekresikan auksin, vit.B 12, dan as. askorbat.  tingkatkan pertumbuhan padi. Nitrogen fiksasi akan dilepas ke lingkungan dlm btk asam-asam amino, protein, dan ZPT. Utk pertum- buhan alaga diperlukan cahaya; inkubasi bbrp minggu pd C. Koloni alga yg terpisah  Ambil & pindahkan ke medium padat / cair utk identifikasi atau simpan sbg kultur stok.

39 Metoda yg paling umum digunakan dlm penyiapan alga sbg pupuk hayati: metoda lubang polythene, dibuat lubang-lubang kecil di sawah/lapangan; tutup dg lembar polythene tebal. Masukkan campuran10 kg tanah dan 200 g superfosfat ke dlm lubang, isi air ± 10 cm; utk atur pH (=7) gunakan kapur. Setelah tanah mengendap  taburkan inokulum ± 100 g ke permukaan air  sekitar 1 minggu mulai pertumbuhan alga di permukaan air  biarkan air mengering  biomassa alga dikeringkan  dpt digunakan 1 minggu setelah penanaman padi dg dosis 10 kg/ha. Penggunaan fungi vesikular-arbuskular mikoriza (VAM) sbg pupuk hayati VAM: jamur non-patogenik yg berasosiasi dg kelompok tumb.tertentu. Ada 3 asosiasi mikoriza: 1) ektomikoriza, pembtkan selubung miselium jamur di sekitar akar tumbuhan 2) endomikoriza, jamur invasi ke dlm akar tumbuhan utk bersimbisis 3) ektendomikoriza, infeksi jamur ektotrofik, hifa terkumpul di dlm sel korteks. Asosiasi VAM berperan bantu serap fosfat dari tanah, meningkatkan pertumbuhan seca- ra signifikan pd tanah yg kekurangan fosfat; jugabantu serap unsur mikro, tingkatkan ZPT, pembtkan bintil akar, serta toleransi tanaman thd cekaman kekeringan. VAM bersifat simbion obligat  tdk dpt ditumbuhkan pd medium buatan terpisah dari tanamannya  penyiapan inokulum berbeda. VAM dpt dihasilkan dg gunakan kultur pot. Inokulum (spora) yg digunakan sbg starterdpt diperoleh dari tanah dg cara penyaringan  spora yg diperoleh sterilkan permukaannya dg chloramin T dan streptomisin  cuci air steril. Penyiapan kultur VAM tanpa tanah akan mengurangi risiko terbawanya mikroba tanah lainnya yg merugikan  misalnya gambut, perlite, vermicullite, pasir, kulit kayu yg diha- luskan. Aplikasi mikoriza dilakukan dg menempatkan inokulum di bawah benih atau bibit seblm ditanam. Utk tingkatkan keberhasilan, sering VAM dikombinasi dg inokulum lainnya yg sesuai utk 1 jenis tanaman, mis. Dg Rhizobium.

40 Skema pembuatan inokulum VAM Tanah Sterilisasi spora VAM Spora VAM Pot steril (diisi pasir dan tanah steril 1:1) Tanaman inang ditumbuhkan pada pot Bibit ditanam Dicek keberadaan spora pada akar Akar dipotong dan dogunakan sbg inokulum awal Inokulum awal (starter) dibenamkan di pot dan benih ditumbuhkan di sekitarnya Inokulasi pot yg lebih besar Bibit diambil setelah 3-4 bulan Akar dihaluskan bersama-sama tanahnya Inokulum VAM siap

41 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Rekayasa genetik / genetic engineering / kloning DNA  teknik gabungkan molekul-molekul DNA secara in vitro  molekuk DNA rekombinan sesuai dg yg diharapkan. Pemuliaan orga- nisme secara konvensional  berlangsung secara in vivo. Skema kloning DNA A. isolasi DNA yg akan di klon B. pemotongan DNA dg endonuklease restriksi C. penyambungan DNA - DNA vektor gunakan DNA ligase D. tranformasi sel inang dg DNA rekombinan hasil ligasi E. analisis & konfirmasi DNA rekombinan dlm sel inang F. Karakterisasi fungsional gen yg diklon A. Isolasi DNA Utk sisipkan suatu gen tertentu ke dlm sel jasad target; perlu terlebih dulu isolasi DNA yg mencakupi gen yg dimaksud  dpt dilakukan dg beberapa cara, yaitu: 1) isolasi DNA genom, dilanjutkan dg pemotongan DNA genom dg endonuklease restriksi 2) isolasi mRNA yg merupakan hasil transkripsi gen yg dimaksud  lanjutkan dg membuat turunan (complementary DNA / cDNA) 3) sintesis nukleotida yg susun gen tsb (buat gen sintetik) dg teknik sintesis kimia 4) lakukan amplifikasi DNA dg teknik PCR (Polymerase Chain Reaction)

42 1) Isolasi DNA genom Prinsipnya: pecah dulu sel dg bbrp agensia, baik secara fisik maupun kimiawi : a) secara fisik: gunakan sonikator, alat yg hasilkan suara dg frekuensi ultra tinggi. Sel disuspensikan dlm senyawa buffer  ujung sonikator masukkan ke dlm suspensi sel.  efektif utk pecah sel bakteri, kurang utk sel eukariota tingkat tinggi (tanaman)  ddg sel b) dg gunakan enzim lisozim yg dpt peceh ddg sel; sering dikombinasi dg perlakuan fisik (mis. pemanasan)  lebih mudah pecah c) gunakan CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide); biasanya utk jar. tanaman Setelah sel pecah  isolasi dan pemurnian DNA; mis. Dg kit yg terdiri dari partikel sa- ngat halus yg dpt ikat DNA tapi tdk ikat molekul lain yg ada dlm sel  bersikan genom dari RNA, protein, dan sisa-sisa sel  akhirnya isolasi gen secara lebih spesifik. Utk isolasi fragmen DNA tertentu  potong DNA genom: - dg enzim endonuklease restriksi tertentu - dg cara mekanis; mis.dg gunakan sonikator; jarang dilakukan (ujung tdk beraturan) Teknik kloning dg cara isolasi DNA genom disebut juga sbg kloning secara acak atau kloning genomik. 2) Isolasi mRNA dan pembuatan cDNA Dibuat turunan DNA yg mencakupi suatu gen dg gunakan mRNA  isolasi mRNA  ubah jadi turunan DNA (cDNA) dg bantuan transkriptase balik (reverse transcriptase) 3) Pembuatan gen sintetis Kini banyak metode sintesis nukleotida secara otomatis atau semi-otomatis. Gen-gen berukuran besar harus sintesis secara bertahap  urutan nukleotidanya dg teknik DNA sequencing. Mungkin bisa dihasilkan “gen” baru yg sama sekali blm pernah ada di alam  blm tentu dpt diekspresikan jadi rangkaian as.amino suatu protein fungsional.

43 4) Amplifikasi DNA dg teknik PCR (Polymerase Chain Reaction), reaksi berantai polimerase. Amplifikasi ini dilakukan secara in vitro dg gunakan: a. enzim DNA polimerase; umumnya dari bakteri thermotoleran, enzim Taq DNA polymerase; tahan thd suhu sangat tinggi (95 – C); DNA cetakan hrs didenaturasi (dipisahkan ikatan antar untaiannya) dg perlakuan panas. Kini juga adaTth DNA polymerase dan Pwo DNA polymerase. b. dNTP – dinukleotida triphosphat: dATP, dTTP, dCTP, dan dGTP; sbg bahan dasarutk buat untaian DNA karena mol.DNA disusun oleh keemoat nukleotida tsb. c. oligonukleotida primer, mol.nukleotida berukuran pendek (10-30 basa nukleotida); yg diper- lukan dlm awali proses sintesis DNA, urutan basa tsb ditentukan agar dpt nempel (kom- plementer) pd mol.DNA detakan yg akan disalin / amplifikasi; dpt dibuat sintesis kimiawi. d. molekul DNA cetakan / DNA template, mol.DNA yg urutan nukleotidanya akan disalin. DNA cetakan diisolasi dari sel  gunakan sbg cetakan yg akan dibaca oleh enzim DNA poli- merase utk membuat salinan urutan nukleotida. Teknik PCR: campur keempat komponen tsb dlm tabung Eppendorf  masukkan ke dlm thermo- cycler ( dpt diatur utk buat suatu siklus perubahan suhu yg diperlukan dlm amplifikasi DNA. Suhu alat diatur C, ± 5 menit  DNA cetakan alami denaturasi; kedua untaiannya terpisah. Pemisahanuntaian dierlukan agar oligonukleotida primer dpt nempel (dg untaian ganda tdk bisa).  Suhu alat diturunkan sesuai utk penempelan primer pd DNA cetakan (± C); tepatnya tergtg urutan basa nukleotida primernya  naikkan 72 0 C utk polimerisasi. Siklus perbahan suhu berulang-ulang kali  didpt mol.DNA baru berlipat ganda. B. Pemotongan DNA dg enzim endonuklease restriksi Enzim tsb diisolasi terutama dari sel prokariota; diklasifikasi (3 tipe) berdasarkan ttk penge- nalan & ttk potong (recognition site and restriction site). Hasil pemotongan: ujung tumpul (le- bih sulit disambung lagi oleh DNA ligase) dan ujung kohesif (sticky  mudah disambung).

44 Bila 2 macam DNA yg asalnya beda tapi punya daerah pengenalan oleh enzim yg sama dipotong dg enzim restriksi yg sama kedua mol.DNA akan memp.ujung-ujung yg komplementer enzim DNA ligase DNA rekombinan C. Penyambungan DNA (ligasi DNA) Mol.DNA yg memp,ujung hasil pemotongan oleh enzim restriksi yg sama  mudah disam- bung oleh DNA ligase  yg sering digunakan: enzim yg gen-nya berasal dari genom virus (bakteriofag) T4  T4 DNA ligase: - mampu sambung DNA ujung kohesif maupun tumpul - mampu sambung RNA dan DNA sedangkan yg dari genom bakteri E. coli hanya mampu sambung 2 ujung yg kohesif. Bila mol.DNA yg akan diligasi memp.ujung-ujung yg tdk sama (karena merupakan hasil pemotongan enzim restriksi yg berbeda)  penyambungan dilakukan dg bbrp modifikasi: a) penambahan adaptor atau penyambung / linker b) pembentukan ekor homopolimer pd ujung DNA c) pengisian ujung-ujung DNA kohesif d) penghilangan ujung DNA kohesif Adaptor: mol. oligonukleotida sintetik yg urutan nukleotidanya dirancang  masing-masing ujung adaptor bersifat komplementer dg masing-masing ujung DNA yg akan disambung.

45 Linker : mol. oligonukleotida sintetik yg dpt alami penyambungan sendiri membtk mol. untai ganda berujung tumpul tetapi memp. urutan nukleotida yg dikenali oleh enzim restriksi tertentu. Linker tsb kemudian difosforilisasidg enzim polinukleotida kinase  sambung dg DNA berujung tumpul dg metoda penyambungan ujung tumpul. Ekor homopolimer: molekul deoksiribonukleotida yg terdiri atas 1 macam nukleotida dan ditambahkan pd ujung 3’ suatu mol.DNA untai tunggal/ganda  DNA tsbdpt mem- btk rekombinan dg DNA lain yg memp. ekor homopolimer yg komplementer. Penambahan Ekor homopolimer dilakukan dg gunakan aktivitas enzim calf thymus terminal deoxynucle- otidyl transferase. Pengisian ujung kohesif dilakukan dg gunakan aktivitas enzim DNA polimerase. Bila ujung -ujung DNA yg akan diligasi sdh dimodifikasi dg salah satu cara di atas  lakukan ligasi. DNA vektor Molekul DNA yg secara khusus dirancang utk bawa mol.DNA asingyg akan dimasukkan ke dlm organisme target. Yg banyak digunakan dlm kloning DNA merupakan vektor buatan yg struktur dasarnya dari komponen genetik alami: plasmid bakteri atau DNA virus tertentu.  dimodifikasi dg + komponen genetik lain hingga dpt digunakanbawa mol.DNA yg akan dipindahkan ke jasad target. DNA vektor dpt lakukan replikasi secara otonomdi dlm sel  dpt perbanyak mol.DNA asingyg disisipkan di dlmnya. Komponen penting suatu DNA vektor: 1) ori, ttk awal replikasi 2) sisi penyisipan fragmen DNA asing 3) penanda genetik 4) sinyal transkripsi dan translasi

46 Titik awal replikasi: suatu urutan nukleotida pd vektor utk awali proses replikasi DNA vektor tsb; replikasi penting utk pertahankan keberadaan vektor itu di dlm sel; sering > 1 ori/vektor  biasanya digunakan utk kloning dan ekspresi gen asing pd organisme eukariot. Sekuens ori I utk replikasi vektor pd inang (biasanya prokariota); berperan dlm perbanyakan DNA utk keperluan manipulasi genetik. Sekuens ori II utk replikasi DNA dlm organisme tempat dilakukannya ekspresi gen asing tsb. Sisi penyisipan DNA asing: sekuens DNA pd vektor yg dpt dipotong enzim restriksi tertentu  dpt digunakan utk me- nyisipkan fragmen DNA asing yg diklon. Sisi ppenyisipan/sisi kloning dpt terdiri atas bbrp urutan nukleotida khusus yg dpt dipotong oleh bbrp enzim restriksi yg berbeda. Penanda genetik (genetic marker) suatu gen vektor yg dpt digunakan utk tentukan koloni sel yg dpt digunakan sbg penanda genetik (mi.ketahanan thd antibiotik, ampisilin); kadang > 1 penanda genetik/vektor; mis. vektor utk kloning gen pd eukariot: - dpt diekspresikan pd sel prokariota  bantu proses identifikasi rekombinan pd tahap- an perbanyakan DNA asing yg disisipkan (bag.proses dlm manipulasi) - khusus yg hanya dpt diekspresikan pd sel eukariota Sinyal transkripsi dan translasi urutan nukleotida yg ditambahkan pd vektor, khusus digunakan utk ekspresikan gen asing yg disispkan; diambil dari daerahpengatur (regulatory region) pd suatu gen & digabungkan dg vektor  gen asing yg disispkan berada tepat pd bag.hilirsinyal transkripsi & translasi itu (downstream). Tdk selalu ada pd setiap vektor, krn ada vektor yg dirancang utk mem- perbanyak DNA asing saja. Umumnya ada 3 kelompok vektor utk kloning DNA: - vektor DNA plasmid - vektor DNA bakteriofag - vektor hibrid DNA plasmid dan bakteriofa

47 a) Vektor DNA plasmid  palinh umum utk kloning; struktur dasar vektor ini berasal dari DNA plasmid alami dlm prokariota dan eukariota. Plasmid yg digunakan umumnya modifi- kasi plasmid alami dg penambahan komponen2 genetik berbagai sumber; misalnya sisi kloning, ori tambahan, dan penanda genetik. Vektor DNA plasmid dibedakan 3 kelompok: 1. vektor utk amplifikasi fragmen DNA asing, 2. vektor ekspresi, dan 3. vektor ulang-alik (shuttle vector) Vektor utk amplifikasi: utk perbanyak fragmen DNA asing yg disisipkan ke dlm plasmid tsb; hanya pd sel prokariota. Vektor ekspresi: utk perbanyak gen yg disisipkan juga dpt mengekspresikan gen tsb.  sering ditambahkan promoter pd bag hulu dari sisi restriksi dan + terminator pd hilir. Vektor ulang alik: ekspresikan gen asing dlm sel eukariota, diperbanyak dulu dlm sel prokariota  2 macam ori dlm vektor ulang alik: - yg dpt digunakan utk replikasi DNA dlm sel prokariota - yg dpt digunakan utk replikasi DNA dlm sel eukariota b) Vektor DNA bakteriofag Struktur dasar berasal dari DNA genom bakteriofag  modifikasi lanjut paling sering di- gunakan: DNA bakteriofag λ dan M 13. Bakteriofag λ dpt lisiskan sel inang E. coli  membtk plaque kumpulan partikel2 virus yg bebas dari sel  sel lisis membtk zona jeri nih; bakteriofag m 13 tdk lisis/bunuh sel inang, hanya turunkan laju pertumbuhannya. c) Vektor DNA hibrid Dikonstruksi gunakan komponen DNA plasmid & DNA bakteriofag; ada 2 vektor DNA hibrid yg sering digunakan; 1) cosmid: vektor yg tersusun atas ori suatu plasmid, penanda genetik, & ujung kohesif bakteriofag λ 2) phasmid: vektor yg dikonstruksi dg DNA plasmid ukuran kecil berturunan banyak serta DNA bakteriofag tertentu. MIs.: bakteriofag P4. Phasmid dpt bereplikasi sbg plasmid atau bersifat litik (  lisisnya sel inang0

48 D. Transformasi sel inang Setelah proses ligasi DNA asing dg DNA vektor  tahap berikutnya memasukkan DNA rekombinan ke dlm sel inang yg sesuai (proses transformasi); karena pemasukan DNA dari luar ke dlm sel tsb akan menyebabkan perubahan (transformasi) pd sifat-sifat genetik sel Inang. Bila DNA yg digunakan berasal dari DNA virus / bakteriofag  transfeksi. Pd kedua cara tsbDNA yg akan dimasukkan (DNA yg “telanjang”) dicampur dg sel inang target. Bila pindahkan DNA itu ada kontak antara sel donor dg sel penerima  konyugasi. Terdpt 2 kelompok sel inang yg ditransformasi: 1) sel inang sementara (temporer), hanya utk perbanyak jumlah mol.DNA rekombinan 2) sel inang tetap  utk ekspresikan gen asing yg diklon tsb Contoh: utk ekspresikan gen asing dlm tanaman, manipulasi genetik utk peroleh & perbanyak DNA rekombinandigunakan sel inang bakteri E. coli (  sel inang sementara), krn mudah & cepat tumbuhnya  transformasi sel tanaman (sel inang tetap). Bila ekspresi gen asing dila- kukan dlm sel bakteri E. coli, maka sel E. coli dpt berperan sbg sel inang utk perbanyak mol. DNA rekombinan, sekaligus utk ekspresikan gen asing yg diklon. Sel inang (tetap / sementara) E. coli karena: - sifat-sifat fisiologi & genetikanya sdh banyak dketahui - pertumbuhannya cepat dan mudah Yg digunakan: sel yg sdh dikembangkan di lab, bukan strain alami; sdh dimutasi  “aman” karena hanya dpt hidup di lingkungan laboratorium secara terkendali  utk security  lepas dari lab  tdk mampu tumbuh di lingkungan bebas. Proses transformasi sel inang E. coli dpt dg cara: 1) teknik induksi kompetensi sel secara kimiawi; diikuti kejutan panas 2) teknik elektroporasi, dg kejutan aliran listrik bertegangan tinggi dlm waktu pendek  ter- btk “lubang” pd permukaan sel  DNA masuk

49 Bila sel inang adalah sel tumbuhan  proses transformasi beda; yaitu dg cara: 1) infeksi sel tumbuhan dg patogen, mis. dg bakteri Agrobacterium tumefaciens atau virus tumbuhan tertentu. 2) pemasukan DNA secara langsung menggunakan alatbiolistic gun bombardment 3) transformasi langsung dg induksi kimia dg senyawa polietilen glikol (PEG) 4) fusi protoplas 5) mikroinjeksi dan makroinjeksi 1) Infeksi dg A. tumefaciens ; bakteri patogen thd tan.dikotil. Bila tan.dikotil terinfeksi  tumor crown gall yg hasilkan seny. turunan as.amino: opine berperan sbg sumber karbon dan nitrogen oleh A. tumefaciens. Kemampuan membtk tumor & metabolisme opine ditentukan oleh plasmid Ti yg ada dlm sel A. tumefaciens. Plasmid Ti mengandung suatu fragmen DNA yg disebut T-DNA yg dpt diintegrasikan ke dlm DNA inti sel tanaman. T-DNA bertanggungjawab thd kemampuan menginduksi pembtkan sel tumor serta sintesis opine  plasmid Ti dlm sel A tumefaciens yg kini di- kembangkan sbg vektor utk masukkan DNA asing ke dlm sel tanaman. --. Terlebih dulu isolasi DNA yg akan disisipkan  klon ke dlm vektor ulang alik khusus yg dpt direplika- sikan di dlm sel E. coli (utk perbanyakan dan manipulasi) serta dlm sel A. tumefaciens. Vektor ulang-alik itu mengandung subfragmen T-DNA ygsdh direkayasa  dpt diguna- kan sbg tempat sisipkan DNA asing. Setelah didisisipi; vektor ulang alik dipindahkan ke dlm sel A. tumefaciens yg bawa plasmid Ti alami yg mengandung T-DNA alami. Di dlm sel A. tumefaciens akan terjadi rekombinasi antara fragmen T-DNA yg sdh disisipi oleh DNA asing dgT-DNA yg ada pd plasmid Ti alami. Pd waktu sel A. tumefaciens yg bawa plasmid Ti rekombinan itu digunakan utk infeksi sel tanaman  bag. T-DNAnya akan di- integrasikan ke dlm DNA inti sel tanaman  DNA asing akan ikut terintegrasikan ke dlm DNA genom tanaman.

50 Penyisipan DNA asing ke dlm DNA genom tanaman dpt pula gunakan DNA virus tanaman sbg vektor  CaMV ( cauliflower mozaic virus). 2) Pemindahan DNA secara langsung dg biolistic gun bombardment (BGB) lapisi proyektil berbahan tungsten dg mol.DNA yg akan dimasukkan ke sel tanaman, tem- bakkan proyektil ke dlm sel tan.  sukses pd transformasi kloroplas Chlamydomonas. 3) Transformasi dg induksi kimiawi; ≈ transformasi pd E. coli, PEG (polyethylene glycol); dpt utk dikotil; hilangkan dulu ddg sel ! 4) Fusi protoplas; fusi protoplas antara 2 tanaman  hilangkan ddg sel secara enzimatis  fusikan secara kimiawi atau elektrofusi  prtoplas hasil fusi diregenerasi jadi sel utuh & jaringan lengkap; ≈ pemuliaan konvensional; namun dpt atasi inkompatibilitas! 5) Mikroinjeksi  injeksi langsung ke dlm sel tanaman. E. Analisis DNA rekombinan Setelah proses transformasi sel inang dg DNA hasil ligasi  analisis keberadaan DNA rekombinan di dlm sel inang (sbg contoh, analisisDNA rekombinan pd E. coli yg biasa sbg inang sementara maupun tetap. Setelah transformasi sel  tumbuhkan sel pd medium selektif sesuai dg penanda genetik yg ada pd vektor yg digunakan. Bila marker itu sifat ke- tahanan thd antibiotik tertentu  sel bakteri yg telah ditransformasi tumbuhkan pd medium agar yg mengandung antibiotik tsb. Secara umum, cara analisis keberadaan DNA rekombinan dlm sel yg ditransformasi: 1. Analisis restriksi DNA 2. Hibridisasi dg pelacak DNA 3. Analisis ekspresi gen asing yg diklon 4. amplifikasi DNA dg teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) 5. Penentuan urutan nukleotida (DNA sequencing)

51 1. Analisis restriksi DNA Praktis & cepat dilakukan bila jumlah koloni transforman yg dianalisis tdk terlalu banyak. Isolasi DNA dari koloni-koloni transforman yg tumbuh pd medium selektif. Setelah laku- kan isolasi DNA plasmid, potong DNA itu dg enzim restriksi spesifik  dpt bedakan anta- ra sel yg bawa DNA rekombinan dg yg bawa DNA vektor saja tanpa sisipan DNA asing. Hasil pemotongan DNA dielektroforesis pd gel agarose  pita-pita DNA  analisis pita 2. Hibridisasi dg pelacak DNA (DNA probe) DNA probe: mol.DNA yg dilabel dg radioaktif atau non-radioaktif; urutan DNAnya dibuat mirip urutan nukleotida DNA rekombinan yg akan dilacak. Pindahkan koloni2 transforman yg muncul pd medium selektif ke ata membran nitroselulosa / nilon  dilisis dg alkali  DNA dlm sel terpapar keluar; lalu membran diinkubasi dg pelacak DNA. Bila ada DNA mirip pelacak; terjadi hibridisasi  gunakan sinyal radioaktif pelacak  dihasilkan image berupa noktah hitam pd film setelah diproses. Hanya bila tersedia pelacak DNA yg sesuai. 3. Analisis ekspresi gen asing Mis. Klon gen yg kode sintesis protein papain dari pepaya. Buat antibodi thd papain; per- lu protein papain yg diisolasi dari daun pepaya  gunaan sbg antigen utk induksi pem- btkan antibodi, (mis.pd kelinci)  gunakan sbg alat deteksi ekspresi gen papain yg diklon Bila ada reaksi positif antara antibodi & antitigen  ada ekspresi gen papain hasil kloning. 4. Amplifikasi DNA dg teknik PCR; hasil amplifikasi dianalisis dg elektroforesis: pita-pita DNA 5. DNAsequencing; lakukan penentuan urutan nukleotida fragmen DNA asng secara rinci. F. Karakterisasi fungsional gen yg diklon --> rancang sistem ekspresi yg sesuai utk gen asing tsb pd sel inang; perlu perhatikan stabilitas gen tsb dlm sel inang. Tan. transgenik  uji pd lingkungan terkendali  uji lapangan  lepas utk dibudidaya.

52 REKAYASA GENETIK PADA TANAMAN Secara umum ada 4 cara utama utk lakukan manipulasi kromosom tanaman: a. seleksi galur murni – pilih galur tan.yg memp.kromosom-kromosom dlm keadaan homozigot pd 1 individu tanaman, dgcara pilih galur tan. dari sejumlah populasi yg memp.variabilitas genetik besar  dpt galur tan.yg benar-benar memiliki sifat-sifat yg dikehendaki. Perlu waktu cukup lama tentukan galur terpilih (tahunan). b. hibridisasi – siapkan 2 galur homozigot (hasil inbreeding self-pollinating plants),  lakukan persilangan / hibridisasi antar individu atau dg fusi protoplas. Metode ini paling sering dilakukan. c. mutasi – induksi mutasi secara spontan atau dg gunakan agensia mutagen kimia / fisik  tan.mutan yg didpt  uji dan seleksi. Metode ini relatif jarang dilakukan karena sering mutasi sebablkan kerusakan pd komposisi genom tan.  timbul sifat-sifat yg justru tdk dikehendaki. d. poliploidi – gunakan kolkisin  rusak pembtkan benang gelenong pd pembelahan sel  duplikasi kromosom. Tan.poliploid cenderung memp.ukuran lebih besar, daun lebih tebal, respons thd lingkungan beda dg diploid  autopoliploid (memp.gen- gen yg serupa dg diploid induknya) dan allopoliploid ( memp. kandungan gen-gen gabungan 2 spesies yg berbeda). Keempat metode konvensional tsb. memp. kelemahan & keunggulan. Keunggulannya a.l.: 1. relatif mudah dilakukan 2. biayanya murah 3. sifat-sifat genetik pd galur-galur baru yg diperoleh umumnya stabil 4. adaptasi pd lingkungan budidaya biasanya relatif mudah Pemuliaan tanaman secara konvensional dg pendekatan hibridisasi ataupun teknik mutasi dg radiasi  terdpt kelemahan-kelemahan.

53 Kelemahan metoda hibridisasi: 1. hanya bisa dilakukan utk tan. yg memp. hub.kekerabatannya dekat 2. sifat genetik & fisiologis baru hasil hibrid tdk dpt diatur dan dikendalikan 3. umumnya perlu waktu lama utk peroleh galur dg sifat baru yg diinginkan Kelemahan metoda radiasi: 1. sifat baru tdk dpt diprediksi, bahkan mungkin merusak sifat-sifat genetis / fisiologis yg unggul (radiasi merusak komposisi genetik) 2. biaya mahal dan relatif sulit bila radiasi dilakukan dg gunakan unsur radioaktif 3. sifat-sifat yg muncul akibat radiasi mungkin tdk stabil Teknik fusi protoplasma: degradasi ddg sel (dg enzim)  + PEG (polietilen glikol) atau dg rangsangan listrik (electric fusion)  kontak protoplas; dpt atasi masalah inkompatible; tapi pemunculan sifat baru juga tdk dpt diprediksi / kendalikan, tergtg pd proses rekombinasi genetik yg terjadi selama proses fusi.  Teknologi DNA rekombinan bisa atasi kelemahan-kelemahan teknik konvensional tsb., karena dilakukan pd tingkat molekul DNA, pindahka suatu gen suatu jasad ke jasad lain; penyisipan gen asing dari jasad apapun ke dlm tan.serta modifikasi genetik pd genom tan. secara terarah, dpt diprediksi. “Kelemahan”: kesulitan teknis penerapan serta biaya mahal. Tahapan rekayasa genetik tanaman meliputi: 1. isolasi gen yg akan direkayasa 2. penyambungan mol.DNA ke dlm vektor (vektor sementara / tetap) & perbanyakannya 3. transformasi sel / jaringan / organ tan.dg DNA rekombinan yg bawa gen asing 4. analisis dan konfirmasi ekspresi gen asing pd tanaman 5. perbanyakan dan diferensiai sel / jaringan tan.yg bawa gen asing  tan.seutuhnya 6. aklimatisasi tan.transgenik sebelim dilepas ke lahan pertanian

54 Isolasi gen tanaman yg akan direkayasa dpt dilakukan dengan: 1. teknik isolasi secara acak: isolasi DNA total tanaman dg cara lisis sel / jaringantan.  potong dg enzim restriksi  bbrp macam ukuran fragmen DNA  pilih yg akan diklon berdasarkan atas ukuran yg dikehendaki 2. teknik PCR; primer yg digunakan utk amplifikasi dpt ditentukan berdasarkan infor- masi yg sdh ada (mis.mengacu pd urutan DNA gen sejenis yg ada pd jasad atau tan.lain, atau gunakan primer universal 3. teknik sintesis cDNA; isolasi mRNA suatu jar.tan,yg diket. / diasumsikan ekspresi- kan gen yg akan diisolasi  gunakan sbg cetakan utk sintesis urutan nukleotida DNA yg komplementer dg enzim transkriptase balik  seleksi cDNA yg diperoleh dg pelacak DNA yg sesuai utk urutan DNA gen yg diklon tsb. Fragmen DNA yg diperoleh  sisipkan pd vektor kloning; hrs dpt utk perbanyakan mol. DNAyg disisipkan seblm akhirnya digunakan utk transformasi sel / jar. tanaman. Vektor yg umum digunakan berbasiskan plasmid Ti yg berasal dari Agrobacterium tumefaciens. Vektor kloning pd tanaman Plasdmid Ti alami berukuran besar (± 200 kb); tdk mungkin gunakan langsung  di- kembangkan vektor kloning yg berbasiskan plasmid Ti alami, yaitu: a) vektor ko-integratif; dpt mengitegrasikan DNA asing dg cara rekombinasi melalui daerah homologi dg plamid Ti yg ada di dlm A. tumefaciens. b) vektor biner; dpt sisipkan DNA asing tanpa harus melalui rekombinasi dg plasmid Ti yg sdh ada di dlm sel A. tumefaciens. Plasmid Ti dpt digunakan utk sisipkan gen asing ke dlm genom tan. karena ada T-DNA yg diintegrasikan ke dlm genom tan.pd waktu A. tumefaciens menginfeksi sel tanaman. DNA asing yg disisipkan pd daerah T-DNA akan ikut terintegrasi ke dlm genom tan.

55 Vektor ko-integratif mengandung: 1) subfragmen T-DNA yg sdh diklon yg digunakan sbg daerah homologi utk proses re- kombinasi 2) bbrp sisi retstriksi yg unik yg dpt disisipi dg DNA asing 3) penanda genetik utk tan.(mis.gen resistensi thd kanamisin) 4) penanda genetik utk bakteri (mis.gen resistensi thd spektinomisin) 5) daerah ori utk replikasi plasmid DNA asing dpt disisipkan pd daerah sisi restriksi; vektor ko-integratif yg sdh disisipi tsb, selanjutnya dpt diperbanyak di dlm sel E. coli sbg inang sementara  vektor rekombinan tsb kemudian dimasukkan ke dlm sel A. tumefaciens yg bawa plasmid Ti alami. Dg adanya daerah homologi antara fragmen T-DNA yg bawa DNA asing pd vektor rekombinan dg da- erah T-DNA pd plasmid Ti  terjai rekombinasi antara kedua plasmid itu  DNA asing dpt terintegrasi ke dlm daerah T-DNA plasmid Ti alami. Bakteri A. tumefaciens yg sdh ba- wa DNA asing itu lalu digunakan utk infeksi tanaman  bag.T-DNA plasmid Ti alami (yg kini sdh bawa DNA asing) akan diintegrasikan ke dlm genom tan. Dan tetap stabil melalui pembelahan mitosis maupun meiosis sel tanaman. Vektor biner dikembangkan utk integrasikan DNA asing ke dlm genom tanaman, tapi tanpa melalui proses rekombinasi homolog dg plasmid Ti alami. Vektor biner mengan- dung bag.t-dna yg penting utk proses transfer DNA ke dlm genom tan.yaitu daerah ujung kanan & kiri pd T-DNA yg terdiri dari 25 pasangan basa: TL-DNA dan T R -DNA. Secara umum vektor biner mengandung: 1) daerah TL-DNA dan T R -DNA yg berasal dari plasmid Ti 2) sisi restriksi utk penyisipan DNA asing yg terletak antara TL-DNA dan TR-DNA 3) penanda genetik utk tan.(mis. gen resistensi thd antibiotik kanamisin) 4) penanda genetik utk seleksi bakteri pembawa vektor mis.gen resistensi thd anti biotik tetrasiklin, dan 5) daerah ori yg digunakan utk replikasi plasmid

56 DNA asing yg akan diintegrasikan ke dlm genom tan.dpt disisipkan pd daerah sisi restrisksi. Vektor rekombinan yg sdh bawa DNA asing lalu dimasukkan ke dlm sel A. tumefaciens yg ba- wa plasmid Ti yg memp.gen viryg utuh. Interaksi antara TL-DNA dan TR-DNA pd vektor re- kombinan dg gen vir  DNA asing yg isisipkan diantara kedua sejuens tsb dpt ditransfer ke dlm genom tan.tanpa melalui rekombinasi dg plasmid TI yg ada dlm sel A. tumefaciens.  Penggunaan vektor biner butuh plasmid “pembantu” utk sediakan gen vir yg utuh; sebalik- Nya penggunaan vektor integratif butuh plasmid TI alami utk lakukan rekombinasi homolog antara vektor rekombinasi dg plasmid TI. Transformasi sel tan.juga dpt dilakukan dg biolistic gun bombardment, transformasi protoplas tan., dan injeksi mikro / makro. Penanda genetik yg digunakan dlm transformasi sel tanaman.  bag. DNA vektor yg digunakan utk tentukan tingkat keberhasilan pemasukan DNA ke dlm sel / jaringan tan. Yg sering digunakan: A. penanda selektif yg dpt bedakan antara sel / jar. yg tidak / alami transformasi; dg lihat pertumb. dlm medium atau kondisi selektif yg tdk me- mungkinkan sel tdk almi transformasi utk tumbuh; B. penanda analitik; didasarkan atas uji / analisis thd ekspresi gen yg dpt dikuantitasi, mis.aktivitas enzim; disebut juga gen reporter. A. Penanda selektif A1. Penanda selektif yg dpt divisualisasi (penanda visibel) a. Penanda histologis; dpt hasilkan kenampakan secara visual pd sel / jaringan tertentu. Penanda ini dpt divisualisasikan dg melakukan pengecatan jar.tanaman ; - gen luciferase yg berasal dari kunang-kunang dan bakteri. Ekspresi gen ini dpt di- deteksi dg prinsip luminensi dg gunakan substrat luminogenik  pendar cahaya spesifik - GFP (Green Fluorescent Protein), protein yg secara alami disintesis di dlm jellyfish (Aequorea victoria)  pendar cahaya hijau bila dipaparkan pd cahaya biru

57 b. Penanda morfologis Penanda genetik yg jika diekspresikan dpt menyebabkan perubahan morfologis pd jaringan tan.yg ditransformasi. Mis.gen yg kode fitokrom dan diekspresikan secara berlebih  timbul efek pleiotropik (multiple effects of a single gene, influencing more than one character). c. Penanda pigmentasi Penanda genetik yg dpt sebabkan terjadinya perubahan warna pd tan.yg ditransfor- masi  gen yg kode sintesis dihidroflavonol reduktase (dari tan.jagung); salah satu gen yg terlibat dlm biosintesis antosianin; pd petunia  warna bunga berubah A2. Penanda yg sebabkan kematian atau viabilitas pd kondisi selektif. a. Penanda resistensi thd antibiotik atau herbisida; telah banyak digunakan. Resistensi tsb dpt dilakukan dg salah satu mekanisme berikut: (1) detoksifikasi dg gunakan modifikasi enzim (2) pengurangan affinitas suatu target thd agensia selektif (antibiotik / herbisida) (3) ekspresi berlebih suatu target tipe alami.  tabel hal. Berikut ! b. Penanda auksotrofik; penanda berupa mutasi pd salah satu / bbrp gen yg terlibat dlm jalur sintesis metabolit tertentu; mis.sintesis as.amino dan sintesis nukleotida B. Penanda analitik Penanda genetik yg digunakan utk mengkuantitasikan ekspresi gen asing pd tan.; gen asing difusikan / disambung dg gen reporter yg akan ekspresikan suatu protein / enzim yg dpt diuji. Adanya ekspresi gen reporter tsb; ada gen asing terfusikan dg gen reporter  memudahkan analisis ekspresi gen yg disisipkan dari luar. Selain metoda kuantitatif penanda analitik dpt diuji kualitatif / semi kualitatif in planta (langsung pd jaringan tan.)

58 Beberapa Penanda Resistensi terhadap Antibiotik atau Herbisida

59 Ekspresi gen asing dlm tan.transgenik dpt dianalisis secara in vivo maupun in vitro. Analisis in vitro dpt dilakukan dg: (1) uji enzimatik, (2) uji aktivitas protein pd gel, (3) uji imunokimia Uji enzimatik dilakukan dg ukur aktivitas produk ekspresi gen reporter yg berupa enzim dg gunakan metode kolorimetri, fluorometri, atau luminometri. Aktivitas enzim tsb dikuantifi- kasi dg menambahkan substrat yg dpt diubah aktivitas katalitik enzim tsb jadi suatu produk. Mis.aktivitas protease diuji dg menambahkan suatu protein yg dpt didegradasi enzim itu ja- di peptida; jmlh peptida yg terbtk dianalisis utk tahu gambaran aktivitas proteolitik enzim itu. Uji aktivitas protein pd gel; protein-protein hasl ekspresi gen pd jar.tanaman dpt dianalisis dg cara melakukan elektroforesis pd gel poliakrilamid  muncul pita-pita berbagai ukuran  analisis aktivitas enzimatiknya dg fluorometri. Uji imunokimia, utk uji protein asing yg bukan enzim  gunakan antibodi thd protein itu  uji imunokimia dg teknik ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) atau immunoblotting. Teknik transfer gen asing ke dlm tanaman Transfer gen suatu jasad ke tana. dpt dilakukan dg (A) transformasi protoplas, (B) trans- formasi sel / jar.tanaman  sifat totipotensi sel tanaman. (A) Transformasi protoplas Protoplas memp.kelebihan utk digunakan sbg bahan awal transfer gen asing ke dlm tan.: Krn transfer gen (plasmid rekombinan) terjadi hanya melalui membran sel (ddg sel sdh dihi- Langkan), dan semua sel tan.transgenik yg diregenerasi dr prtoplas akan mengandung gen asing tg diinginkan  tan.memp.komposisi genetik yg seragam.Transformasi protoplas dg gen asing dpt dilakukan dg bbrp cara: a. gunakan senyawakimia tertentu, mis.PEG b. teknik elektroporasi c. gunakan perantara bakteri A. tumefaciens d. transfer gen dg sonifikasi e. transfer gen dg perantaraan liposome.

60 Liposome dpt digunakan utk transfer gen asing ke dlm protoplas tanaman; liposome yg bawa plasmid difusikan dg protoplas menggunakan PEG; kelebihan teknik ini: (1) DNA ter- Lindungi dari kemungkinan adnya aktivitas nuklease, (2) toksisitas liposome rendah, (3) DNA yg ada dlm liposome lebih stabil dlm penyimpanan, dan (4) dpt diaplikasikan pd ba- nyak tanaman. (B). Transformasi sel atau jaringan tanaman yg utuh. Transfer dpt digunakan dg metoda: (1) transformasi gunakan perantara A. tumefaciens, (2) biolistik, dan (3) mikroinjeksi / makroinjeksi. (lihat skema di halaman berikut !) (1) Transformasi tan.dg perantaraan A. tumefaciens. Plasmid rekombinan dibuat dg menyisipkan gen asing ke dlm T-DNA yg ada pd plasmid Ti  pindahkan plasmid rekombinan ke dlm bakteri A. tumefaciens. Hal ini dpt dilaku- kan dg menggunakan teknik konyugasi antara bakteri E. coli yg membawa plasmid re- kombinan, dg bakteri A. tumefaciens yg bawa plasmid Ti sbg plasmid pembantu (helper plasmid). Sel A. tumefaciens yg sdh membawa gen rekombinan selanjutnya ditumbuhkan bersa- ma jar.tan.yg akan ditransformasi (disebut teknik ko-kultivasi). Jar.tan.yg akan di- kokultivasi dg A. tumefaciens dpt diambil dari irisan daun (leaf disc)  celupkan seben- tar ke dlm kultur A. tumefaciens berumur semalam  letakkan pd kertas filter steril  letakkan pd medium selektif utk proses ko-kultivasi dg bakteri A. tumefaciens 2-3 hari. Medium itu juga mengandung antibiotik yg sesuai, herbisida atau bahan kimia lain yg bersifat selektif  hanya jar. tan,.yg telah alami transformasi saja yg tetap dpt tumbuh. Jaringan tanaman yg tumbuh tsb. diteruskan sampai berkembang membtk bakal tanam- an (plantlet)  pindahkan ke pot berisi tanah utk pertumbuhan lanjut. Utk analisis keber- hasilan: uji dg teknik DNA blotting, PCR, atau analisis ekspresi gen asing yg disispkan.

61 Skema Transfer Gen Asing (DNA Rekombinan) ke dalam Sel Tanaman untuk Menghasilkan Tanaman Transgenic. Selain ketiga metode tersebut masih ada metode lain yaitu mikroinjeksi dan makroinjeksi.

62 Skema Transformasi Tanaman Menggunakan Teknik Ko-kultivasi dengan Bakteri Agrobacterium tumefaciens yang Membawa Plasmid Rekombinan. Dalam skema di samping digunakan contoh penggunaan sistem plasmid biner untuk kloning gen asing ke dalam tanaman.

63 (2) Transfer gen ke dlm tanaman dg teknik biolistik Dlm teknik biological ballistic, sel / jar.tan.ditembakidg alt tembak mikroprojektil yg mem- bawa DNA rekombinan (dikembangkan th.1987 oleh Prof.Stanford cs. Un. Cornell). Teknik ini sesuai utk diterapkan pd tan.yg sulit alami regenerasi dg teknik kultur in vitro atau yg tdk kompatibel dg teknik ko-kultivasi dg A. tumefaciens spt padi dan jagung. Alat ± spt di halaman berikut. Microcarrier mengandung partikel tungsten yg dilapisi DNA yg akan ditembakkan. Sel / jar.diletakkan di bawah stopping plate ; penembakan dg alirkan gas helium pd kecepatan tinggi  dorong microcarrier mengandung DNA lewati stopping plate  tembus sel / jar.  regenerasi pd medium yg sesuai  tan.transgenik utuh. (3) Metoda mikroinjeksi dan makroinjeksi jaringan tanaman Mikroinjeksi: injeksikan DNA asing ke dlm sel-sel embrio, gunakan alat mikromanipulator & alat khusus lain; injeksi ke nukleus / sitoplasma. Seblmnya DNA di-amobilkan mis. dg agarose, agar, atau Na-alginat. Yg berpengalaman,dpt injeksi sel /jam. Makroinjeksi dilakukan dg menginjeksikan DNA total dari 1 varietas, misalnya kapas, ke dlm varietas kapas lainnya. Aplikasi rekayasa genetik pada tanaman Pengembangan teknologi DNA rekombinan utk tan.transgenik  implikasi sangat besar pd bidang pertanian  pemuliaan tanaman sesuai yg diinginkan. Aspek yg dikembangkan meliputi - perbaikan sifat fisiologis tan. Mis. Pengubahan kandungan as.lemak, tingkatkan kandungan provit.A., ubah warna bunga, penundaan pemasakan - pengembangan resistensi tan.thd hama dan penyakit tanaman - pengembangan resistensi tan.thd herbisida - hasilkan protein terapeutik, antibodi monoklonal maupun vaksin rekombinan yg diekspresi- kan di dlm bag. tan. tertentu misalnya buah

64 Skema Alat Biolistik untuk Melakukan Transformasi Sel Tanaman

65 Spesies tanamanGen yg disisipkkanAsal genKarakterbaru yg diperoleh Oryza sativa (Golden rice) Gen pengkode: Phyton synthase Lysopene cyclase Phytoene desaturase Daffodil Erwinia carotovora Produksi provitamin A (β-karoten) pd endo- sperm Oryza sativaGen phosphinothricin N-acetyltransferase Streptomyces hygroscopicus Toleransi thd herbisida phosphinothricin, khusus nya glufosinate amonium Lycopersicum esculentum Gen pengkode S-ade Nosylmethionine hydrolase Bakteriofag T3Penundaan pemasakan krn biosihtesis etilen ber- kurang Zea maysGen pengkode toksin CrylAb B, thuringiensis subsp. Kurstaki Resisten thd pengerek Batang Ostrinia subilalis Carica papayaGen pengkode coat protein Papaya Ring- spot Virus (PRSV) Papaya Ringspot Virus Resisten thd PRSV Glycine max L.Gen pengkode δ-12 Desaturase (fad 2) KedelaiAkumulasi as.lemak oleat  as.lemak tak jenuh Beberapa macam tanaman transgenik yg sudah dikembangkan


Download ppt "Sejarah perkembangannya: 3000 s.M  minuman beralkohol (melalui fermentasi); namun dasar-dasar ilmiahnya baru pada abad ke-17. 1680 – Leeuwenhoek  amati."

Presentasi serupa


Iklan oleh Google