Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Pengujian Inhibisi hyaluronidase Kelompok 5 Chintya komalasari (G451130041) Dodi irwandi (G451130161) Era rahmi (G451130191) Shelly Rahmania (G851130351)

Presentasi serupa


Presentasi berjudul: "Pengujian Inhibisi hyaluronidase Kelompok 5 Chintya komalasari (G451130041) Dodi irwandi (G451130161) Era rahmi (G451130191) Shelly Rahmania (G851130351)"— Transcript presentasi:

1 Pengujian Inhibisi hyaluronidase Kelompok 5 Chintya komalasari (G ) Dodi irwandi (G ) Era rahmi (G ) Shelly Rahmania (G ) Ummi zahra (G ) SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014

2 Enzim Hyaluronidase  Hyalurodinase, enzim penghidrolisis suatu mukopolisakarida (Hyaluronate), suatu polisakarida terdiri dari unit berulang asam D-glukuronik dan N-asetil-D-glukosamin  Penyebab beberapa penyakit diantaranya alergi yang disertai inflamasi.  Ketika enzim berada dalam keadaan tidak aktif, keberadaan ion logam seperti kalsium secara in vivo berhubungan dengan degranulasi sel mast yang menyebabkan dihasilkannya mediator penyebab alergi dan inflamasi

3 Enzim Hyalurodinase Hidrolisis Ikatan  (1-4) pada asam hyaluronase N-asetil- D- Glukosamin Alkali Intermediat Glukosazolin + + p dimetilaminobenzaldehid (p-DMAB) Senyawa berwarna A 585 nm Prinsip Pengujian

4 bufer asetat (0.1 M, pH 3.5)  Sodium asetat (0.1 M)  Asam asetat glasial (0.1 M) Enzim hyaluronidase Potassium hyaluronate kalsium klorida(2.5 mM) Sodium hidroksida (0.4 N) Potassium tetraborate 0.8 N, pH 9.1, (dengan penambahan KOH 5 M) p-Dimethylaminobenzaldehyde HCL 10N Air bebas ion Sampel Uji Screw cap test tubes (Pyrex) Mikropipet Water bath Timer UV/VIS spectrophotometer pH meter Pipet Volumetri Beakers Labu tentukur Measuring cylinders Peralatan dan Bahan Bahan Peralatan

5 NoNama AlatJumlah 1UV/VIS spectrophotometer (kuvet)1 2pH meter1 3Water bath1 4Mikropipet1 5Timer1 6Screw cap test tubes (Pyrex)20 7Pipet volumetri 3 ml2 8Gelas Piala 100 ml1 9Gelas Piala 400 mL1 10Labu tentukur 25 mL1 11Labu tentukur 100 mL1 12Labu tentukur 1000 mL1 13Measuring cylinders DAFTAR KEBUTUHAN ALAT

6 NoNama BahanKebutuhan 1Bufer asetat (0.1 M, pH 3.5)100 mL 2Sodium asetat (0.1 M)100 mL 3Asam asetat glasial (0.1 M)150 mL 4Enzim hyaluronidase10 mg 5Potassium hyaluronate10 mg 6Kalsium klorida(2.5 mM)100 mg 7Sodium hidroksida (0.4 N)25 mL 8Potassium tetraborate 0.8 N, pH mL 9KOH 5 M25 mL 10p-Dimethylaminobenzaldehyde100 mL 11HCL 10N25 mL 12Air bebas ion 13Sampel Daftar Kebutuhan Bahan/Reagen

7 1 Preparasi bufer dan larutan 2 Preparasi larutan enzim dan larutan substrat. 3 Aktivasi enzim Hyaluronidase 4 Inhibisi enzim Hyaluronidase teraktivasi 5 Inhibisi enzim Hyaluronidase inaktif 6 Hitungan persentasi inhibisi TAHAPAN PENELITIAN

8 Pembuatan Larutan NaOH 0,4 N 1,6 gram NaOH 100 mL aquades 1 Preparasi bufer dan larutan

9 1.94 g CH3COONa Tera akuades Larutan A Larutan B mL as.asetat glasial Tera akuades 46.3 mL larutan B mL larutan A Tera akuades 1 Preparasi bufer dan larutan Buffer asetat (0.1 M, pH 3.5) Labu takar 100 mL

10 12.5 mL HCl (10 N) Tera dengan asam asetat glasial Labu takar 100 mL 1 Preparasi bufer dan larutan p-dimetilaminobenzaldehida

11  p-dimetilaminobenzaldehida (p-DMAB) (67mM) P-DMAB 10 g Tera dengan pelarut p-DMAB Labu takar 100 mL Larutan stok Larutan p-DMAB yang digunakan 1 mL stok Tera dengan asam asetat glasial Labu takar 10 mL 1 Preparasi bufer dan larutan

12 EnzimBufferKonsentrasi (M) pH bufferKonsentrasi enzim (N.F.Unit/mL) HyaluronidaseAsetat Larutan Enzim 2 Preparasi larutan enzim dan larutan substrat. 25 ml bufer asetat 17,5 mg enzim hyaluronidase Larutan enzim Stok awal enzim = 500 u/mg

13 SubstratBufferKonsentrasi (M) pH buffer Konsentrasi substrat (N.F.Unit/mL) Kalium Hyaluronat Asetat Larutan Substrat 2 Preparasi larutan enzim dan larutan substrat.

14 3 Aktivasi enzim Hyaluronidase 400 µl enzim hyaluronidase (350 N.F units/ml bufer asetat) 100 µl larutan CaCl 2 (2,5 mM bufer asetat) Inkubasi T=37 o C, t=20 menit Larutan enzim teraktivasi

15 5 Inhibisi enzim Hyaluronidase teraktivasi

16 Bahan yang digunakan Blangko (µl) Kontrol (-) (µl) Kontrol (+) (µl) Sampel (µl) Ket Enzim hyaloronidase (buffer asetat) 400 (Buffer) 400 Sampel--100 (sodium aurothiomalat) 100 DMSO Inkubasi; T = 37 o C, t = 20 menit, dalam penangas air CaCl Inkubasi; T = 37 o C, t = 20 menit, dalam penangas air Kalium hyaluronat 1,2 mg/mL (substrat) 500 Inkubasi; T = 37 o C, t = 20 menit, dalam penangas air NaOH 0,4 N100 Kalium tetraborat 0,8 N pH 9,1 100 Panaskan di dalam air mendidih selama 3 menit didinginkan dengan air p-DMAB 67 mM 3000 Diukur absorbansi pada 585 nm 5 Inhibisi enzim Hyaluronidase inaktif

17 1.Tambahkan 400 µL larutan enzim hialoronidase 2.Menambahkan 100 µL sampel diinkubasi pada 37 o C selama 20 menit Inhibisi dari enzim hyaluronidase yang tidak teraktivasi

18 Tambahkan 100 µL CaCl 2 (2,5 mM dalam buffer asetat (mengaktifkan enzim) diinkubasi pada 37 o C selama 20 menit Tambahkan 500 µL Kalium hyaluronat (substrat) 1,2 mg/mL buffer asetat diinkubasi pada 37 o C selama 20 menit Inhibisi dari enzim hyaluronidase yang tidak teraktivasi

19 Reaksi enzim dihentikan dengan menambahkan 100 µL NaOH 0,4 N dan 100 µL Kalium tetraborat 0,8 N pH 9,1 Dipanaskan 3 menit kemudian tabung didinginkan di atas air dingin Absorbansi larutan tersebut diukur pada 585 nM Inhibisi dari enzim hyaluronidase yang tidak teraktivasi 3 mL larutan p-dmab 67 mM

20 PERHITUNGAN Contoh perhitungan

21 SampelUlangan Konsentrasi (ppm) Absorban Sampel Absorban Blangko % InhibisiIC 50 (ppm) IC rata-rata (ppm) Data absorbansi pada panjang gelombang 585 nm Form disiapkan 2, masing-masing untuk 1) Enzim yang diaktifasi 2) Aktivasi enzim yang tidak aktif

22 Terima Kasih

23 U/mg 500 u/mg Untuk 1 mg = 500 unit 350 u = 350/500 x 1 mg = 0,7 mg Untuk 25 ml buffer asetat = 0,7 x 25 mL = 17,5 mg


Download ppt "Pengujian Inhibisi hyaluronidase Kelompok 5 Chintya komalasari (G451130041) Dodi irwandi (G451130161) Era rahmi (G451130191) Shelly Rahmania (G851130351)"

Presentasi serupa


Iklan oleh Google