Acetylcholinesterase Inhibition Assay

Presentasi berjudul: "Acetylcholinesterase Inhibition Assay"— Transcript presentasi:

1 Acetylcholinesterase Inhibition Assay
OLEH : Ina Ristian (G ) Dewi Pratiwi (G ) Fatan Umbara (G ) Nurikhsan Fistoro (G ) Fahmi Hasim (G )

2 Acetylcholinesterase Inhibition Assay
Asetilkolinesterase Saraf Pusat Berperan penting Reseptor Asetilkolin Perifer Saraf-saraf dan Sinapsis Neuromuskular

3 Penghambatan hidrolitik dari neurotransmiter kationik
Enzim Tugas Fisiologis

4 Target yang menarik untuk desain rasional
Asetilkolinesterase Target yang menarik untuk desain rasional Penemuan mekanisme penghambatan Alzaimer Dimensia Pikun Inhibitor Asetilkolinesterase Ataksia Meningkatkan proses memori jangka panjang dengan meningkatkan aktivitas kolinergik

5 Mekanisme inhibisi enzim Acetylcholinesterase

6 Spectrophotometric Assay
Bahan-bahan : Buffer fosfat 1 (0.1 M, pH 8.0) Buffer fosfat 2 (0.1 M, pH 7.0) Buffer Reagen Ellman, DTNB Asetilkolin Iodida, 75 mmol/L Asetilkolinesterase (AChE) Mikropipet Pipet gelas Stop watch Water bath Spektrofotometer UV-Vis Sampel Uji (ekstrak yang belum murni, produk alam, senyawa sintetik)

7 Preparasi Reagen Buffer Fosfat-1 (For enzyme and test) larutkan
NaOH 100 mmol/L hingga pH = 8, T = 250C 1.56 g Na2HPO4.2H2O + H2O 75 mL Larutan buffer akan stabil selama tidak ada kontaminasi dari mikroba Simpan temperatur 4 0C Aquades hingga 100 ml

8 Preparasi Reagen Buffer Fosfat -2 (For Ellman’s reagent, DTNB)
larutkan NaOH 100 mmol/L hingga pH = 7, T = 250C 1.56 g Na2HPO4.2H2O + H2O 75 mL Larutan buffer akan stabil selama tidak ada kontaminasi dari mikroba Simpan temperatur 4 0C Aquades hingga 100 ml

9 Preparasi Reagen Reagen Buffer Ellman (DTNB, 0.1M/1; NaHCO3,17.85 mmol/l) larutkan + 10 mL lar. Buffer fosfat-2 39.6 mg DTNB + 15 mg NaHCO3 Larutan ini dapat bertahan selama 4 minggu setelah dibuat Simpan pada temperatur 4°C.

10 Preparasi Reagen Acetylthiocholine iodide (75 mmol/l) (Substrate)
larutkan mg acetylthiocholine iodide Simpan pada temperatur 4°C. + dalam 5 ml akuabides Larutan ini dapat bertahan selama 7 hari setelah dibuat

11 Simpan dalam water bath dengan temperatur 5°C.
Preparasi Reagen Acetylcholinesterase (Enzyme) Enzim dilarutkan dalam buffer-1 hingga konsentrasi campuran menjadi 0,00025U/ml Simpan dalam water bath dengan temperatur 5°C.

12 Pembuatan deret konsentrasi
Preparasi Sampel Larutan stok 2000 ppm larutkan ditera hingga 5 mL 10 mg sampel + DMSO Pembuatan deret konsentrasi V1.M1 = V2.M2 5 mL 7.81; 31.25; 62.50; 125; 250; 500; dan 1000 ppm

13 Pengujian Larutan Sampel acetylcholinestrase inhibition assay
2.80 ml lar. buffer fosfat μl lar. sampel + 30 μl larutan stok enzim + 100 μl larutan stok DTNB + 30 μl larutan stok subtrat Inkubasi 5-10 menit, suhu 25 0C Ukur pada ʎ = 412 nm

14 7 deret konsentrasi sampel, masing-masing 3 ulangan
B1 s2 B2 Kp Kn B0 7 deret konsentrasi sampel, masing-masing 3 ulangan Blangko masing-masing 2 ulangan Keterangan: S1 = Sampel 1 S2 = Sampel 2 Kp = Kontrol positif (eserin) Kn = Kontrol negatif B0 = Blangko dari Kp dan Kn (bufer fosfat 1 + DTNB + substrat) B1 = Blangko dari sampel 1 (bufer fosfat 1 + sampel 1 + DTNB + substrat) B2 = Blangko dari sampel 2 (bufer fosfat 1 + sampel 2 + DTNB + substrat)

15 Kurva Hubungan Antara Konsentrasi Inhibitor Dengan Aktivitas Enzim

16 Ilustrasi acetylcholinestrase inhibition assay
Buffer Fosfat-1 Acetylcholinesterase larutan sampel DTNB Inkubasi 5-10 menit pada suhu 25 0C Acetylthiocholine iodide Kemudian dianalisis pada panjang gelombang 412 nm

17 Terima kasih