Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

MARKER BIOKIMIA. Deteksi dengan menggunakan marker isozymes, allozymes Deteksi tidak langsung (gene products): Deteksi langsung (DNA sequence): SSRs RAPDs.

Presentasi serupa


Presentasi berjudul: "MARKER BIOKIMIA. Deteksi dengan menggunakan marker isozymes, allozymes Deteksi tidak langsung (gene products): Deteksi langsung (DNA sequence): SSRs RAPDs."— Transcript presentasi:

1 MARKER BIOKIMIA

2 Deteksi dengan menggunakan marker isozymes, allozymes Deteksi tidak langsung (gene products): Deteksi langsung (DNA sequence): SSRs RAPDs AFLPs ISSRs SNPs others RFLPs Biochemical marker Allozyme Non-PCR based marker RFLP, Minisatellite (VNTR) PCR based marker Microsatellite, RAPD, AFLP, CAPS (PCR-RFLP), ISSR, SSCP, SCAR, SNP, etc. Traditional marker systems PCR generation: in vitro DNA amplification

3 Isozymes and Allozymes Mutasi menyebabkan perbedaan pada komposisi asam dan basa asam amino, tetapi tidak menyebabkan perubahan fungsi enzim Perubahan kecil pada struktur primer dapat mengubah struktur sekunder Lactate Dehydrogenase Dym et al 2000: PNAS 97:9413–9418 Isozim adalah enzim-enzim yang memiliki molekul aktif dan struktur kimia yang berbeda tetapi mengkatalis reaksi kimia yang sama.

4 Isozim/Allozim (marker biokimia) Teknik : Elektroforesis dan pewarnaan enzim Bentuk alternatif dari protein tertentu yang divisualisasi pada gel sebagai band dengan mobilitas yang berbeda. Polymorphism karena adanya mutasi sebuah asam amino diganti, muatan elektrik protein mungkin berubah

5 Allozyme diversity …ATG-CTA-GCT… DNA …Met-Leu-Ala… Protein …AGG-CTA-GCC… …Arg-Leu-Ala… Silent Replacement mutations

6 Allozymes: Allelic isozymes: bentuk berbeda dari sebuah enzim yang dikode pada lokus yang sama Isozim adalah bentuk yang bermacam-macam dari enzim tertentu. Isozim dapat diisolasi dan diidentifikasi dengan elektroforesis dan pewarnaan tertentu

7 Konsep dari isozim adalah sebagai berikut: 1.Bentuk molekular enzim yang lebih dari satu (isozim) adalah umum terdapat pada organisme. 2. Isozim berbagi aktivitas katalitik umum. Tiap isozim memiliki tugas spesifik dalam lintasan metabolik dan berfungsi dengan harmonis dengan enzim lain dalam organisasi sel. 3. Isozim sering menunjukkan sel atau jaringan yang khusus. 4. Heterogenitas molekular dari isozim confers flexibility, versatility and precision upon an organism in terms of metabolic functions.

8 Transportasi dan penyimpanan sampel Penanganan sampel merupakan bagian penting dari metode untuk mendapatkan ekstrak enzim yang baik. Koleksi biji harus tetap disimpan dingin dan kering selama di perjalanan, tetapi biji relatif toleran terhadap fluktuasi suhu. Jika disimpan, sebaiknya disimpan di refrigerator atau dibekukan. Sampel daun sebaiknya tetap dingin, lembab dan teraerasi. Keadaan basah dan anaerobic menyebabkan tumbuhnya jamur dan kematian sampel. Sampel daun sebaiknya disimpan di refrigerator dan tidak dibekukan. Persiapan sampel

9 Ekstraksi enzim harus dilakukan segera setelah sampel daun tiba di lab. Perkecualian untuk pine bud dapat disimpan di -80C dalam waktu lama atau disimpan dalam liquid nitrogen.

10 EKSTRAKSI 0.2M phosphate buffer pH % bovine albumin 0.1% dithiothreitol 2.0% sodium ascorbate 10.0% PVP % 2-mercaptoethanol (optional) ANGIOSPERM FOLIAGE: Same as conifer foliage, but: increase PVP-40 to 12% FOLIAGE and Pine buds:

11 Sampel daun: Digerus/dihancurkan X mg sampel daun dengan 2X ul buffer ekstraksi hingga menjadi serbuk dalam liquid nitrogen. Jangan dibiarkan sampai mencair. Simpan microtube pada -80 sampai siap digunakan. Pada hari elektroforesis dilakukan, cairkan dan sentrifuge tabung. Letakkan dalam es sampai sampel dimasukkan di gel.

12 Detection Dipisahkan melalui elektroforesis pada gel pati atau pada gel poliakrilamida Isozim dideteksi berdasarkan aktivitas enzim Pewarna mengandung substrat untuk enzim, kofaktor, dan oxidized salt (dye) Pola-pola yang teramati disebut zymogram Hillis, D.M., C. Moritz and B. K. Mable Molecular Systematics, 2nd ed. Sinauer Assoc. Inc., Sunderland, Mass

13 Persiapan Gel Elektroforesis Introduction: Teknik gel yang berbeda : agarosa, poliacrylamide dan pati dapat digunakan untuk elektroforesis isozim. Gel dibuffer secara kimia ke dalam pH spesifik dan menjadi matriks yang dilalui oleh enzim bermigrasi sebagai respon terhadap arus listrik. Gel pati banyak digunakan untuk studi isozim. Gel pati mudah dipotong sehingga pewarnaan dapat dilakukan untuk bermacam-macam enzim dalam satu kali runnung elektroforesis.

14

15 Sebelum elektroforesis proteins adalah molekul terpolarisasi

16 Setelah elektroforesis

17 Malate Dehydrogenase (MDH1) sunflower gel allelle 2 allelle 1 invariant mito. band l-102 B-4 MDH PI PI PI A B C D E Isozyme Raw Data gel by M. Brothers

18 Hubungan kekerabatan/hubungan genetik dalam dan antar populasi, sering berhubungan dengan struktur geografik. Keragaman genetik pada spesies tanaman klon Forestry and agriculture Conservation biology Aplikasi Seed bank populations (Cabin 1998, McCue 1998) Perubahan lingkungan dan heterogenitas habitat (Lehman 1997) Patologi tumbuhan (Leuchtman 1996) Koleksi plasma nutfah (Lamboy 1996)

19 Miroslav Zeidler ACTA UNIVERSITATIS PALACKIANAE OLOMUCENSIS FACULTAS RERUM NATURALIUM BIOLOGICA 38: 1-10


Download ppt "MARKER BIOKIMIA. Deteksi dengan menggunakan marker isozymes, allozymes Deteksi tidak langsung (gene products): Deteksi langsung (DNA sequence): SSRs RAPDs."

Presentasi serupa


Iklan oleh Google