Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Hibah Tim Penelitian Pasca Sarjana (HTPP) Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional No : APHT/2003/0011/018 Polimorfisme dan.

Presentasi serupa


Presentasi berjudul: "Hibah Tim Penelitian Pasca Sarjana (HTPP) Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional No : APHT/2003/0011/018 Polimorfisme dan."— Transcript presentasi:

1 Hibah Tim Penelitian Pasca Sarjana (HTPP) Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional No : APHT/2003/0011/018 Polimorfisme dan Isoform Gen Reseptor FSH Wanita Indonesia : Implikasinya Pada Penanganan Infertilitas dan Kesehatan Reproduksi Purnomo Soeharso 1, Nukman H. Moeloek 1 dan Farid A. Moeloek 2 1) Departemen Biologi Kedokteran, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta. 2) Bagian Obstetri dan Ginekologi, Rumah Sakit Umum Pusat Negri Cipto Mangun Kusumo (RSUPN CM), Jakarta.

2 Pendahuluan 1. Infertilitas pada wanita meliputi 45% dari semua kasus infertilitas. 2. Mempunyai implikasi pada masalah kependudukan, distribusi kemakmuran dan kesejahteraan pada tingkat keluarga dan negara. 3. Penanganan infertilitas adalah penting dalam pengelolaan kesehatan reproduksi di Indonesia.

3 4. Program reproduksi berbantuan merupakan salah satu upaya mengatasi masalah infertilitas untuk mendapatkan keturunan bagi pasangan infertil. 5. Stimulasi ovarium oleh gonadotropin (FSH & LH) adalah mekanisme sentral dalam pengaturan siklus reproduksi wanita. 6. Respon ovarium terhadap stimulasi FSH eksogen pada wanita usia reproduksi yang mengikuti program reproduksi berbantuan (IVF/ICSI) bervariasi pada beberapa individu.

4 - Stimulasi FSH pada ovarium berlangsung melalui interaksi antara FSH dengan reseptor spesifiknya (reseptor FSH) pada sel-sel granulosa ovarium. - Variasi reseptor FSH menyebabkan perbedaan afinitas FSH terhadap reseptornya pada sel target sehingga menghasilkan respon bervariasi pada beberapa individu : tidak ada respon, respon lemah, respon baik atau sindrom hiperstimulasi. - Varian reseptor FSH dapat dihasilkan oleh isoform yang ditentukan oleh genotip dan polimorfisme pada promoter gen reseptor FSH

5  Isoform reseptor FSH adalah varian genotip yang ditentukan oleh polimorfisme pada exon 10 gen struktur reseptor FSH.  Polimorfisme pada exon 10 posisi : 307 menghasilkan kode Ala atau Thre 680 menghasilkan kode Asn atau Ser Pada wanita Kaukasia menghasilkan 3 isoform Asn/Asn, Asn/Ser, Ser/Ser.  Skrining polimorfisme promoter gen reseptor FSH menghasilkan 5 polimorfisme pada promoter inti pada posisi –138, - 114, - 91, - 37 dan – 29.

6 Peta gen struktur reseptor FSH

7 Model skematis daerah 5’ flanking gen RFSH manusia

8 Permasalahan 1. Distribusi isoform dan polimorfisme promoter gen reseptor FSH pada wanita Indonesia belum diketahui. 2. Perlu dibuktikan adanya hubungan antara isoform reseptor FSH dengan sensitifitas ovarium terhadap stimulasi FSH eksogen. 3. Perlu dibuktikan adanya hubungan antara polimorfisme promoter gen reseptor FSH dengan ekspresi reseptor FSH pada sel-sel granulosa ovarium.

9 4. Pengaruh isoform dan polimorfisme promoter gen reseptor FSH pada kelainan atau penyakit hormonal seperti amenorhoea primer dan endometriosis belum diketahui. 5. Pengaruh isoform dan polimorfisme promoter gen reseptor FSH pada kelainan fungsi ovarium seperti ovarium polikistik dan sindroma resistensi ovarium belum diketahui.

10 Tujuan umum : Mengetahui isoform reseptor FSH dan polimorfisme promoter gen reseptor FSH sehingga dapat menentukan efektifitas stimulasi FSH terhadap ovarium. Meluluskan 2 peserta program S3 dan 4 peserta program S2 Biomedik pada akhir 2005.

11 Tujuan khusus : 1. Mengetahui hubungan antara isoform dan polimorfisme promoter gen reseptor FSH dengan level FSH basal. 2. Mengetahui efektifitas stimulasi FSH pada reseptor FSH yang mempunyai isoform dan polimorfisme gen promoter berbeda secara in vitro. 3. Membuat prediksi dosis FSH yang efektif untuk induksi ovarium pada wanita yang mengikuti program reproduksi berbantuan IVF/ICSI berdasarkan data isoform reseptor FSH dan polimorfisme promoter gen reseptor FSH.

12 4. Membuat kesimpulan tentang perlunya mendeter minasi isoform reseptor FSH dan polimorfisme gen promoternya sebagai faktor predisposisi pada kasus-kasus endometriosis, ovarium polikistik dan menopouse prematur atau late menopouse. 5. Menentukan teknik yang sensitif untuk mendeter- minasi isoform atau genotip reseptor FSH.

13 Metodologi : Topik penelitian dibagi menjadi 6 subtopik, tiap subtopik dikerjakan oleh seorang mahasiswa. Subtopik I : Polimorfisme gen reseptor FSH (isoform reseptor FSH) pada wanita Indonesia yang mengikuti program reproduksi berbantuan IVF/ICSI. oleh : Dwi Anita Suryandari, S.Si., M.Biomed Mahasiswa S3 Biomedik FKUI lama penelitian: 3 tahun

14 Subtopik II : Polimorfisme pada promoter gen reseptor FSH wanita Indonesia usia reproduktif dan pengaruhnya terhadap expresi reseptor FSH. oleh : Yuni Ahda, S.Si., M. Biomed Mahasiswa S3 Biomedik FKUI lama penelitian : 3 tahun. Subtopik III : Pengaruh isoform FSH pada kelainan hormonal endometriosis oleh: Monica Dwi Hartanti, dr. Mahasiswa S2 Biomedik FKUI lama penelitian : 1 tahun.

15 Subtopik IV : Determinasi polimorfisme gen reseptor FSH (isoform reseptor FSH) dengan teknik PCR-SSCP dan PCR-RFLP. oleh : Daniel Joko Wahyono, Drs. Mahasiswa S2 Biomedik FKUI. lama penelitian: 1 tahun. Subtopik V : Pengaruh isoform reseptor FSH pada kelainan ovarium polikistik. oleh: Laksmi Wingit Ciptaning, S.Si. Mahasiswa S2 Biomedik FKUI lama penelitian : 1 tahun.

16 Subtopik VI : Pengaruh isoform FSH dan polimorfisme promoter gen reseptor FSH pada usia rata-rata menopause wanita Indonesia dengan riwayat siklus reproduksi normal. oleh: ditentukan kemudian Mahasiswa S2 biomedik FKUI lama penelitian: 1 tahun

17 Cara Kerja : isolasi DNA dari sampel darah Amplifikasi exon 10 Amplifikasi promoter inti PCR-SSCP & PCR- RFLP PCR-SSCP & DNA sequencing Uji sensitifitas isoform in vitro Uji aktifitas promoter untuk melihat kapasitas expresi in vitro Deteksi cAMP level pada sel granulosa Mengukur aktifitas reporter gen luciferase yang ditransfeksi ke sertoli cell line

18 Hasil penelitian tahun II 1. Koleksi sampel Sampel darah dikumpulkan dari pasien & volunteer oleh mahasiswa peneliti sesuai dengan keperluannya masing-masing. 2. Optimasi teknik mendeterminasi isoform & polimorfisme promoter gen reseptor FSH  Amplifikasi exon 10 gen reseptor FSH untuk determinasi isoform reseptor FSH dengan PCR. Primer D dan G1 untuk amplifikasi exon 10 yang mengcover situs polimorfik posisi 680 : 5’ GAG CAA GTG TGG CTG CTA TG 3’ 5’ TGT GCA AAG AGA CCA GGA GC 3’

19 Primer kedua untuk amplifikasi DNA exon 10 yang mengcover situs polimorfik posisi 307 : 5’ GCT ATA CTG GAT CTG AGA TG 3’ 5’ ACC ACT TCA TTG CAT AAG TC 3’  Amplifikasi DNA promoter inti gen reseptor FSH pada rentang antara –231 dan –1 dengan PCR menggunakan primer : 5’ TAT TCC AGA CAT GCC TAA TGG 3’ 5’ CCA GCA AAG AGA CCA GGA GC 3’  Teknik SSCP & RFLP amplikon exon 10 gen reseptor FSH dan promoter inti gen reseptor FSH.  Sikuensing DNA untuk konfirmasi hasil SSCP.

20 Amplifikasi exon 10 gen reseptor FSH dengan primer mengcover posisi situs polimorfik bp

21 Analisa SSCP exon 10 gen reseptor FSH posisi 680 menghasilkan 3 genotip (isoform) FSH Asn/SerSer/SerAsn/Asn

22 Amplifikasi exon 10 gen reseptor FSH dengan primer mengcover posisi situs polimorfik pb

23 Analisis SSCP exon 10 gen reseptor FSH posisi 307 menghasilkan 3 genotip (isoform) FSH    Ala/Ala Thr/Thr Ala/Thr

24 PCR-RFLP gen reseptor FSH exon 10 posisi 680 dengan enzim restriksi Bsr1.

25 Hasil amplifikasi daerah promoter inti reseptor FSH manusia (231 bp) pb (pb) M ekson 1 intron A

26 Analisis SSCP promoter inti gen reseptor FSH wt

27 Distribusi isoform dan genotip reseptor FSH pada wanita Indonesia berbeda dengan yang terjadi pada wanita Kaukasia (Jerman) Tabel 2. Frekuensi genotip pada posisi 307 dan 680 exon 10 gen FSHR Posisi 680 Posisi 307 Asn/Asn (%) Asn/ser (%) Ser/Ser (%) Thre/Thre21910 Thre/Ala12306 Ala/Ala3610

28 Perbandingan distribusi genotip antara kelompok kontrol dan kelompok wanita infertile anovulatory normogonadotropik (WHO-2) berdasarkan polimorfisme gen FSHR posisi 307 dan 680.

29 Tabel 3. Hubungan isoform reseptor FSH dengan level FSH basal Genotip Reseptor FSH Rata-rata konsentrasi FSH serum hari 3 postmenstruasi Thre/Thre6,74 ± 2,4 Thre/Ala6,48 ± 2,5 Ala/Ala7,88 ± 2,7 Asn/Asn6,67 ± 3,05 Asn/Ser6,73 ± 2,3 Ser/Ser6,86 ± 2,1

30 Posisi polimorfisme yang ditemukan pada promotor inti reseptor FSH manusia

31 Frekuensi polimorfisme promoter inti gen FSHR pada wanita Jerman dan Indonesia Persentase polimorfisme Posisi polimorfisme

32 Produk PCR promoter inti yang telah diidentifikasi Klon ke dalam vektor TOPO Keluarkan fragmen DNA promoter dari vektor TOPO Subklon ke vektor expresi pGL3 yang membawa reporter luciferase Transfeksikan ke certoli cell line Assay luciferase activity

33 Ekspresi relatif (rata-rata  SEM) konstruksi pGL3/promotor inti RFSH

34 Grafik hubungan polimorfisme dengan rata- rata hari penyuntikan FSH sampai OPU Rata-rata hari penyuntikan FSH Promotor

35 Tabel 4. Frekuensi isoform reseptor FSH pada penderita endometriosis dibanding kontrol Isoform 680 Isoform 307 Asn/AsnAsn/SerSer/SerAla/AlaAla/ThrThr/Thr Kontrol (normal) N = 500,380,140,480,2040,3670,429 Endometriosis N = 420,300,450,250,1670,500,333

36 Tabel 1. Perbandingan efektifitas PCR-SSCP dan PCR-RFLP untuk mendeterminasi polimorfisme exon 10 posisi 680 gen FSHR.  2 = 4,66 P  0,05 Jumlah Sampel (N) Sampel yang teridentifikasi Sampel tidak teridentifikasi Sensitifitas pemeriksaan PCR-SSCP ,986 PCR-RFLP ,612

37 Rencana kerja tahun ke III Subtopik I Uji sensitifitas isoform FSH terhadap stimulasi FSH in vitro. - Sel granulosa diisolasi dari ovarium wanita yang telah dideterminasi isoform reseptor FSHnya, peserta program reproduksi berbantuan pada waktu ovum pick up. - Sel granulosa dikultur pada medium standart dan distimulasi FSH eksogen beberapa menit. - Respon sel granulosa terhadap stimulasi FSH diukur dari perubahan level cAMP sel granulosa sebelum distimulasi FSH dan sesudah distimulasi FSH dengan khromatografi pertukaran ion.

38 Sel granulosa ovarium (dicuci dengan Hank’s basic salt solution)  Dikultur pada media standart RPMI + serum, 24 jam Stimulasi FSH, 15 menit Freeze -20  C, 30 menit Lisis sel dengan deterjen Triton X-100 Pisahkan & ukur cAMP dengan khromatografi pertukaran ion

39 Subtopik III Uji PCR-SSCP gen reseptor FSH pada wanita dengan endometriosis dan hubungannya dengan level FSH basal Subtopik IV Membandingkan efektifitas uji PCR-SSCP dan PCR- RFLP untuk mendeterminasi isoform reseptor FSH.

40 Subtopik V Uji PCR-SSCP gen reseptor FSH pada wanita dengan ovarium polikistik. Subtopik VI Uji PCR-SSCP gen reseptor FSH pada wanita dengan usia menopouse berbeda & riwayat siklus reproduksi normal.

41 Kesimpulan :  Pola distribusi genotip dan polimorfisme promoter gen reseptor FSH pada populasi wanita Indonesia berbeda dengan pola distribusinya pada populasi wanita kaukasia (Jerman).  Genotip Ala/Thre dan Ser/Ser pada wanita Indonesia berimplikasi pada sensitivitas ovarium yang rendah terhadap stimulasi FSH eksogen.  Polimorfisme promoter inti gen reseptor FSH pada -129 menurunkan aktivitas promoter secara signifikan.  PCR-SSCP adalah teknik yang sensitif dan reliabel untuk mendeterminasi isoform reseptor FSH dan polimorfisme promoternya.

42 Publikasi Ilmiah Hasil Penelitian Ahda, Y., Soeharso, P., The expression of follicle-stimulating hormone receptor in ovary and testis. Med. J. Indones. 12 : 187 – 193, Joop Laven, S.E., Annemarie, G.M., Mulders, G.J., Suryandari, D.A., Gromoll, J., Nieschlag, E., Fauser, J.M, Simoni, M. Follicle-stimulating hormone receptor polymor phisms in women with normogonadotropic anovulatory infertility. Fertil. Steril. 80 : 986 – 992, Ahda, Y., Gromoll, J., Soeharso, P., Inawati, S, Moeloek, N. Single nucleotide polymorphisms of follicle- stimulating hormone receptor promoter and their impacts to the promoter activities. Med. J. Indones. 13 : 2005 – 214.

43 Presentasi dalam seminar Soeharso, P., Ahda, Y., Moeloek, N. The variation of luciferace reporter gene expression driven by the core promoter of human FSH receptor gene with different point mutation, 2 nd Conference on Medical Sciences, 18 – 21 August 2002, Medan. Suryandari, D.A., Moeloek, N., Soeharso, P., Gromoll, J., Simoni, M. Analisis polimorfisme gen FSHR pada 51 wanita Indonesia dan 187 wanita Rotterdam, PIT XIV Perkumpulan Andrologi Indonesia, 18 – 19 Juli 2002, Sanur, Bali. Soeharso, P., Ahda, Y., Moeloek, N. Uji ekspresi gen reporter luciferase untuk mengukur aktivitas gen promoter reseptor FSH dan bentuk polimorfik nya. PIT XIV Perkumpulan Andrologi Indonesia, 18 – 19 Juli 2002, Sanur, Bali.

44 Laven, J., Mulder, A., Suryandari, D.A., Gromoll, J., Nieschlag, E, Fauser, B., Simoni, M., Soeharso. P., Moeloek, N. Polimorfisme gen FSHR pada wanita infertil anovulatory gonadotropik (WHO-2). Seminar Nasional PBBMI, 2 Oktober 2004, Yogyakarta. Ahda, Y., Gromoll, J., Soeharso, P., Inawati, S., Moeloek, N. Single nucleotide Polymorphisms (SNPs) promoter gen reseptor FSH dan pengaruhnya terhadap aktivitas promoter. Seminar Nasional PBBMI, 2 Oktober 2004, Yogyakarta. Wahyono, D.J., Suryandari, D.A., Moeloek, N., Soeharso, P. Perbandingan sensitivitasmetoda PCR-SSCP dengan PCR-RFLP untuk deteksi polimorfisme kodon680 ekson 10 gen FSHR. Seminar Nasional PBBMI, 2 Oktober 2004, Yogyakarta.

45 Terima kasih


Download ppt "Hibah Tim Penelitian Pasca Sarjana (HTPP) Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional No : APHT/2003/0011/018 Polimorfisme dan."

Presentasi serupa


Iklan oleh Google