Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

SEMINAR HASIL DOSEN MUDA

Presentasi serupa


Presentasi berjudul: "SEMINAR HASIL DOSEN MUDA"— Transcript presentasi:

1 SEMINAR HASIL DOSEN MUDA
PENYUSUNAN PUSTAKA DNA GENOMIK RHIZOBAKTERI PENGHASIL IAA oleh: lily syukriani,sp fuji astuti,ssi. Msi selvi elvia pembimbing: Prof.dr.sc.agr.ir.jamsari,mp

2 PENDAHULUAN Kira-kira 25% dari luas daratan Indonesia mrpk ultisol
Permasalahan tanah ultisol hara makro rendah, hara mikro tinggi meracuni tanaman menghambat pertumbuhan akar Mikroorganisme di dalam tanah dapat memacu pertumbuhan tanaman menghasilkan auksin, giberelin, etilen, dll

3 Auksin sangat berperan dalam pertumbuhan dan perkembangan tanaman terutama dalam perbesaran dan pembelahan sel, mempengaruhi permeabilitas membran sel, peningkatan respirasi pada jaringan tanaman, memacu sintesis mRNA serta protein enzim berupa protein struktural, inisiasi pembentukan akar, dll

4 Biosintesis auksin tidak hanya pada tanaman tingkat tinggi tetapi juga pada mikroorganisme seperti fungi, bakteri, actinomycetes dan alga. Kemampuan rhizobakteri memproduksi IAA dapat dimanfaatkan untuk peningkatan dan perbaikan pertumbuhan tanaman melalui teknologi rekayasa genetika

5 Gen yang diperoleh dari pustaka genom dapat digunakan untuk memproduksi IAA dalam jumlah besar
Pustaka DNA mrpk sekumpulan sekuens DNA dari suatu organisme yang masing- masing telah diklon ke dalam vektor tertentu untuk memudahkan pemurnian , penyimpanan, dan menganalisisnya.

6 TUJUAN PENELITIAN Memperoleh isolat rhizobakteri yang mampu menghasilkan IAA Menyusun pustaka DNA genomik rhizobakteri penghasil IAA tertinggi

7 BAHAN DAN METODE Penelitian ini dilakukan mulai bulan April – Januari 2010, di laboratorium Bioteknologi dan Pemuliaan Tanaman Lt II Jur BDP Faperta Unand Penelitian ini terdiri dari 2 tahap : 1. Identifikasi rhizobakteri penghasil IAA 2. Penyusunan pustaka DNA rhizobakteri penghasil IAA

8 I. Identifikasi rhizobakteri
A. Secara fisiologis 1. Pengambilan sampel tanah 2. Isolasi rhizobakteri 3. Uji gram 4. Uji pigmen fluorescen 5. Uji kemampuan rhizobakteri dalam memproduksi IAA

9 HASIL DAN PEMBAHASAN No Kode Isolat Asal Tanaman Uji Gram
Uji Fluorescen OD IAA 1 Al 1 Alang-alang Negatif Tidak ada 0.113 10.53 2 Al 2 0.101 9.41 3 Al 3 Positif 0.096 8.94 4 Al 4 0.276 25.71 5 Al 5 0.071 6.61 6 Al 6 7 Al 7 0.132 12.3 8 Al 8 0.117 10.9 9 Al 9 0.061 5.68 10 Al 10 0.336 31.3 11 Al 11 0.289 26.92 12 SK 1 Sikaduduk 0.092 8.57 13 SK 2 0.303 28.22 14 SK 3 0.09 8.38 15 SK 4 0.062 5.78 16 SK 5 0.065 6.05 17 SK 6 0.221 20.59 18 SK 7 0.102 9.5 19 SK 8 0.079 7.36 20 PR 1 Paku resam 21 PR 2 0.094 8.76 22 PR 3 0.156 14.53 23 PR 4 0.109 10.15 24 PR 5 0.162 15.09 25 PR 6 0.123 11.46

10 26 PR 7 Paku resam Positif Tidak ada 0.142 13.23 27 PR 8 Negatif 0.067 6.24 28 PR 9 0.15 13.97 29 PR 10 0.057 5.31 30 PR 11 0.047 4.38 31 PR 12 0.107 9.97 32 PR13 0.099 9.22 33 PR 14 0.101 9.41 34 PR 15 0.093 8.66 35 PR 16 36 PR 17 0.234 21.8 37 PM 1 Pimping 0.109 10.15 38 PM 2 0.135 12.58 39 PM 3 0.052 4.84 40 PM 4 0.155 14.44 41 PM 5 0.1 9.32 42 PM 6 0.077 7.17 43 PM 7 0.172 16.02 44 PM 8 0.108 10.06 45 KM 1 Karamunting 0.078 7.27 46 KM 2 0.095 8.85 47 KM 3 0.13 12.11 48 KM 4 0.094 8.76 49 PT 1 Polysticum sp 0.068 6.33 50 PT 2 0.082 7.64

11 ket : a = isolat Al 10 , b = isolat Al 4, c = isolat PR 17,
Dari 50 isolat dipilih 6 isolat yang menghasilkan IAA tertinggi untuk selanjutnya dilakukan uji pertumbuhan bakteri sekaligus uji kemampuan rhizobakteri menghasilkan IAA setiap 4 jam Grafik 1. Laju pertumbuhan dan kemampuan isolat menghasilkan IAA, ket : a = isolat Al 10 , b = isolat Al 4, c = isolat PR 17, d =isolat SK 6, e = isolat SK 2, f = isolat Al 11 A B S O R N WAKTU PENGAMATAN (JAM)

12 B. Secara molekuler Isolat yang menghasilkan IAA tertinggi (Isolat Al 11) diidentifikasi secara molekuler 1. Isolasi DNA Menggunakan metode Leah, White, Rhoad & Leung (1994) M 1 M = λ DNA 50, 1 = DNA isolat Al 11

13 2. Amplifikasi gen 16S rRNA DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan menggunakan kombinasi primer yang didesain dari sekuen gen ­16S rRNA. Kombinasi primer yang digunakan adalah 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) dan 1525R (5’-AAGGAGGTGWTCCARCC-3’). Reaksi PCR dilakukan pada total volume 25 µl yang terdiri dari 2 µl DNA templet, 2 µl kombinasi masing-masing primer 27Fdan 1525R (5 pmol/µl), 21 µl ddH2O PCR dalam RTG-PCR Bead. Amplifikasi dilakukan sebanyak 30 siklus pada mesin PCR (Biometra-Jerman).

14 M 1 1500 bp M = 1 Kb, = produk PCR Hasil elektroforesis dari fragmen produk PCR dengan ukuran sekitar 1500 bp, yang merupakan ukuran yang diharapkan bila menggunakan kombinasi primer 27F dan 1525R dari sekuens gen 16S rRNA

15 2. Analisis sekuens gen 16S rRNA
Sekuensing dilakukan di PT CPI (Chaeron Phokphand Ind) di Jakarta. Sekuensing dilakukan satu arah (one read direction) menggunakan primer 1525R, kemudian diedit menggunakan bantuan paket software DNASTAR (Madison Wisconsin-USA) dan dikontrol secara manual.

16 C. Analisis BLAST sekuen DNA
Analisis BLAST dilakukan untuk membandingkan data sekuens yang dimiliki dengan sekuens-sekuens DNA dari berbagai penjuru dunia dan tanaman yang didepositkan pada database (gen bank) sekuens publik. Analisis BLAST dilakukan secara online pada website NCBI (National Centre of Biotechnology Information) .

17 Kode akses Deskripsi Max. Identifikasi
FN FN GQ AY EU Acinetobacter genomosp.3 partial 16S rRNA gene, strain bpoe1350 Acinetobacter genomosp.3 partial 16S rRNA gene, strain bpoe1348 Uncultured bacterium clone G S rRNA gene, partial sequence Acinetobacter calcoaceticus strain HPC253 16S rRNA gene, partial sequence Acinetobacter calcoaceticus strain D9 16S rRNA gene, partial sequence 93%

18 Bakteri Acinetobacter calcoaceticus merupakan bakteri gram negatif, mampu menghasilkan IAA, siderophor, pelarut phospat (Prashantt, Makarand, Bhushan, Sudhir, 2008) 8 strain Acinetobacter yang di isolasi dari rhizosfir tanaman gandum mampu menghasilkan IAA (Huddedar1, Shete,  Tilekar, Gore, Dhavale, Chopade, 2002)

19 II. Penyusunan Pustaka DNA
1. Isolasi DNA genomik rhizobakteri 2. Pemotongan parsial DNA rhizobakteri 3. Preparasi DNA plasmid 4. Ligasi fragmen ke dalam vektor 5. Transformasi vektor ke dalam sel inang 6. Seleksi koleksi rekombinan 7. Analisis ukuran insert

20 2.Penyusunan Pustaka DNA
1. Isolasi DNA rhizobakteri konsentrasi DNA cukup tinggi kira-kira 600 ng ng. M Gambar 1. Hasil elektroforesis isolasi DNA rhizobakteri ‘G’, M = λ DNA 50, = DNA rhizobakteri ‘G’

21 2. Pemotongan parsial DNA rhizobakteri
Penggunaan enzim EcoRI karena kompatibel dengan plasmid PUC18. Menghasilkan pita smear antara 4-10 kb. M u u u u u 7 u Gambar 2. Hasil elektroforesis restriksi menggunakan enzim EcoRI, M = 1 kb, 10000 bp 4000 bp

22 3. Isolasi dan pemotongan DNA plasmid PUC 18
Vektor yang digunakan untuk penyusunan pustaka DNA ini adalah PUC18 yang berukuran 2686 bp. PUC18 ini sebelum dipergunakan perlu diperbanyak terlebih dahulu di dalam E.coli, setelah itu baru DNA plasmid diisolasi. M Gambar 3. Hasil elektroforesis isolasi DNA PUC18, M = 1 kb, 1 = DNA PUC18

23 4. Ligasi dan transformasi
Ligasi antara fragmen DNA ‘G’ dengan plasmid PUC18 dilakukan dengan enzim T4 DNA ligase, yang kemudian langsung ditransformasi menggunakan metode heat shock, hasil transformasi ini ditumbuhkan pada media LB padat yang mengandung ampicilin, X-gal dan IPTG.

24 Gambar 4. Hasil transformasi klon rekombinan ke dalam E.coli DH5α
Koloni putih = koloni rekombinan = 176 koloni Koloni biru = non rekombinan = 6 koloni

25 6. Analisis ukuran insert
Koloni putih yang dihasilkan kemudian diamplifikasi menggunakan primer M13RF, dengan kondisi PCR predenaturasi 940C selama 2 menit, denaturasi 940C selama 1 menit, anneling 550C selama 1 menit, extensi 720C selama 1 menit, final extensi 720C selama 7 menit. Amplifikasi ini bertujuan untuk mengetahui berapa fragmen DNA yang telah terinsert Gambar 5. Hasil elektroforesis amplifikasi koloni rekombinan, M = 1 kb, 1-2 = DNA ‘G’ M 1000 bp

26 Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa setelah diamplifikasi ternyata fragmen DNA yang terinsert ke dalam vektor adalah sebesar lebih kurang 1000 bp – 103 bp (panjang primer M13) = 897 bp

27 KESIMPULAN 1. Dari 50 isolat yang diisolasi dari rhizosfir tanaman ultisol mampu menghasilkan IAA, Isolat Al 11 merupakan penghasil IAA tertinggi dari rhizosfir tanaman alang-alang sebanyak 26,92 ppm 2. Penyusunan pustaka DNA telah berhasil dilakukan dengan terinsertnya fragmen sekitar 897 bp

28 TERIMA KASIH


Download ppt "SEMINAR HASIL DOSEN MUDA"

Presentasi serupa


Iklan oleh Google