Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Pengristalan protein. Langkah penentuan struktur Penyiapan sampel murni Pembuatan kristal Pengumpulan data kristalografi Pembuatan dan penyelesaian model.

Presentasi serupa


Presentasi berjudul: "Pengristalan protein. Langkah penentuan struktur Penyiapan sampel murni Pembuatan kristal Pengumpulan data kristalografi Pembuatan dan penyelesaian model."— Transcript presentasi:

1 Pengristalan protein

2 Langkah penentuan struktur Penyiapan sampel murni Pembuatan kristal Pengumpulan data kristalografi Pembuatan dan penyelesaian model struktur Analisis struktur

3

4

5 Pengristalan Kristal tunggal → analisis struktur XRD Kalau perlu dalam gravitasi mikro Prosedur coba-coba (trial and error) Makin murni protein, makin baik kesempatan menumbuhkan kristal Syarat lain protein: memiliki sifat permukaan yang sama (muatan yang sama) → untuk pengemasan molekul dalam kristal)

6 Tahap penting pengristalan 1.Penentuan kemurnian protein 2.Pelarutan protein dalam pelarut yang cocok → dengan garam atau pelarut organik (untuk protein membran perlu deterjen) 3.Pengkondisian superjenuh untuk pembentukan inti kristal → pembentukan agregat kecil 4.Pertumbuhan kristal → pengikatan molekul baru pada permukaan inti krital

7 Kurva kelarutan protein

8 Pengendapan protein Melalui penambahan garam, PEG, atau pelarut organik –Garam: salting out (pelemahan gaya tolak dan dehidarasi permukaan protein) –PEG: menarik air dan mengimobilisasi air –Pelarut organik: efek elektrostatik (gaya elektrostatik ~ 1/tetapan dielektrik) Melalui pengubahan pH dan suhu

9 Berapa gram protein? Ukuran kristal yang umum: 0,2 × 0,2 × 0,2 mm (0,008 mm 3 atau sekira 10 µg protein) 1 mg protein → 100× percobaan Pretein membran sangat sulit dikristalkan –Cara lama penambahan detergen –Cara lain: fase kubus lipid sebagai matriks pengristalan protein

10 Teknik pengristalan Metode batch Difusi cair-cair Difusi uap –Tetes menggantung –Tetes duduk Dialisis

11

12 Contoh: kristalisasi fosfolipase A membran luar Hanging-drop vapour diffusion Protein solution: 8 mg/ml OMPLA 1,5%  -oktil-glukosida 10 mM buffer suksinat, pH 6,5 1 mM NaN 3 Reservoir solution : 25-29% 2-metil,2,4-pentanediol 1 mM CaCl 2 0,1 M Bis-Tris pH 6.0

13 Kristal amilase 40% PEG mM Ca-asetat 100 mM cacodylate pH 6.5, 40% PEG mM CaCl 2 50 mM NaCl 100 mM MES pH % PEG mM MES, pH mM CaCl 2 25 mM NaCl Protein: 10 mg/ml

14 Tetes: 1  l ABS (9.0 mg/ml) + 1  l lar pengendap, pada 20 o C Larutan pengendap: 0.1 M NaAc pH 4.6, 1.5% PEG1500 Kristal batang Tumbuh setelah 4 hari (ukuran 300 × 2 × 2 µm) Kristal ABS (fragmen FBP)

15 Catatan awal kristal Muka datar (merefleksikan kemasan teratur molekul, ion, atau atom) Periksa dengan mikroskop pemolarisasi

16 Persiapan percobaan XRD Kristal: 40–60% berisi air/pelarut –Keuntungan: dapat melakukan reaksi dalam kristal –Kerugian: labil karena air mudah menguap Cryo (100–120 K, N 2 cair) →perlu cryoprotectant Mounting kristal Letak pada kepala goniometer Amati data osilasi sekira 0,15 o Ambil data hingga 3 o

17

18 Persamaan Bragg: 2 d sin θ = λ

19 Difraksi

20 Difraksi dalam 3D

21 Catatan Pengristalan: tahap utama dalam XRD No crystal no structure Mounting kristal: perhatikan ketebalan kapiler Pola sinar-X (sinar terdifraksi sering disebut refleksi)


Download ppt "Pengristalan protein. Langkah penentuan struktur Penyiapan sampel murni Pembuatan kristal Pengumpulan data kristalografi Pembuatan dan penyelesaian model."

Presentasi serupa


Iklan oleh Google