Enzim Pemotong Asam Nukleat DNAase : enzim yg dapat memotong DNA RNAase: enzim yg dapat memotong RNA DNAase ada yang hanya memotong DNA untai tunggal, ada yg hanya memotong untai ganda DNAase dibagi menjadi 2: Endonuklease : memotong dari bag dalam DNA Eksonuklease : memotong dari bag luar

Enzim Endonuklease Restriksi Ditemukan tahun 1962 di dalam bakteri Bakteri E. coli memiliki sistem kekebalan enzimatik yang dapat mengenal dan menghancurkan DNA asing 3,000 telah diidentifikasi, ratusan telah dikomersialkan

Enzim Endonuklease Restriksi: Enzim endonuklease yang bersifat khusus, yaitu hanya memotong DNA untai ganda yang mempunyai urutan nukleotida tertentu. Ada tiga tipe : Enzim endonuklease tipe I, tipe II,dan tipe III

Enzim Endonuklease Tipe I Enzim ini mempunyai aktivitas endonuklease sekaligus metilase dan memerlukan ATP, Mg2+, dan S-adenosil metionin sebagai kofaktor. Selain itu, enzim endonuklease restriksi tipe I juga mempunyai aktivitas ATPase.

Enzim Endonuklease Tipe I Enzim ini mengenali urutan nukleotida tertentu (recognition site) yang berupa urutan pasangan basa sebagai berikut: EcoK, mengenali urutan 5’AACNNNNNNGTGC-3’, EcoB mengenali urutan 5’-TGANNNNNNNNTGCT-3’. Huruf N menyatakan basa nukleotida apa saja (tidak spesifik).

Enzim Endonuklease Tipe I Meskipun enzim ini secara spesifik mengenali daerah tertentu, tetapi enzim ini memotong DNA pada daerah yang berlainan dengan daerah pengenalannya sehingga pemotongannya tidak spesifik. Dalam aplikasinya untuk rekayasa genetik, enzim endonuklease restriksi tipe I ini tidak banyak dipergunakan

Endonuklease restriksi tipe II Endonuklease restriksi tipe II mempunyai perbedaan mendasar dengan tipe I karena enzim tipe II mempunyai spesifitas. Daerah yang dikenali maupun daerah yang dipotong enzim tersebut bersifat spesifik dan terletak pada bagian yang sama.

Endonuklease restriksi tipe II Enzim ini sangat stabil dan hanya memerlukan Mg2+ sebagai kofaktor. Enzim endonuklease restriksi tipe II dapat dibedakan atas urutan nukleotida yang dikenali yang dapat berupa urutan empat, lima, atau enam basa spesifik. Sampai saat ini telah ratusan macam enzim tipe II yang berhasil diisolasi dari bermacam-macam bakteri.

Daerah pengenalan endonuklease restriksi tipe II Contohnya enzim EcoRI yang diisolasi dari bakteri Escherichia coli RY13 mempunyai daerah pengenalan dan pemotongan DNA berupa urutan 5’-GAATTC-3’. Jika basa nukleotida komplemen urutan tersebut dibaca dari ujung 5’ maka juga akan memberika urutan yang sama sebagai berikut: 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’

Hasil pemotongan EcoRI: ujung kohesif= ujung lekat Urutan basa nuklleotida semacam itu disebut urutan palindrome. Enzim EcoRI secara spesifik memotong ikatan antara G dan A sehingga hasil pemotongannya menghasilkan molekul DNA dengan ujung yang tidak sama panjang dan sering disebut ujung kohesif atau ujung lekat (cohesive end atau sticky end) sebagai berikut: 5’-G AATTC-3’ 3’-CTTAA G-5’

Kerja Enzim restriksi EcoR1

Sticky ends and blunt ends Ujung lancip dan ujung tumpul Enzim mengenal urutan spesifik 4-8 bp Beberpa enzim memotong dg pola - “sticky ends” EcoRI 5’…GAATTC…3’ 3’…CTTAAG…5’ Beberpa enzim memotong dg pola – “blunt ends” PvuII 5’…CAGCTG…3’ 3’…GTCGAC…5’

Penggunaan dalam rekayasa genetik Human DNA cleaved with EcoRI Corn DNA cleaved with EcoRI + 5’-C-G-G-T-A-C-T-A-OH 3’-G-C-C-A-T-G-A-T-C-T-T-A-A-G-PO4 PO4-G-A-A-T-T-C-A-G-C-T-A-C-G-3’ HO-T-C-G-A-T-G-C-5’ 5’-A-C-G-G-T-A-C-T-A G-A-A-T-T-C-A-G-C-T-A-C-G-3’ 3’-T-G-C-C-A-T-G-A-T-C-T-T-A-A-G T-C-G-A-T-G-C-5’ Complementary base pairing + DNA Ligase, + ATP recombinant DNA molecule 5’-A-C-G-G-T-A-C-T-A-G-A-A-T-T-C-A-G-C-T-A-C-G-3’ 3’-T-G-C-C-A-T-G-A-T-C-T-T-A-A-G-T-C-G-A-T-G-C-5’

Ujung lekat dapat disambung dengan mudah dengan enzim DNA ligase Kedua ujung hasil pemotongan tersebut akan dengan mudah disambung lagi dengan menggunakan enzim DNA ligase, oleh karena itu ujung-ujungnya sering disebut ujung kohesif.

Endonuklease restriksi tipe II Enzim AluI Enzim ini mengenali urutan 5’-AGCT-3’ dan memotong DNA tersebut menjadi molekul dengan ujung tumpul ( blunt end), karena memotong ikatan antara G dan C

Enzim endonuklease restriksi tipe II merupakan kelompok enzim yang paling banyak digunakan dalam teknologi DNA rekombinan (rekayasa genetik) untuk memotong DNA secara spesifik.

Endonuklease restriksi tipe III Endonuklease restriksi tipe III juga memotong DNA pada bagian yang spesifik tetapi pada daerah yang berdekatan dengan daerah pengenalannya. Enzim ini juga memerlukan ATP dan Mg2+ untuk aktivitasnya, tetapi tidak mempunyai aktivitas ATPase serta tidak memerlukan S-adenosil metionin seperti enzim endonuklease restriksi tipe I.

Endonuklease restriksi tipe III Salah satu contoh enzim endonuklease restriksi tipe III adalah enzim HgaI yang mengenali urutan urutan basa nukleotida 5’-GACGC-3’, tetapi memotong DNA pada urutan basa kelima atau kesepuluh dari urutan yang dikenali tersebut. Enzim tipe ini sangat jarang digunakan dalm teknologi DNA rekombinan.  

Tata Nama Enzim endonuklease restriksi Sejak penemuannya pada 1970an, lebih dari 100 jenis enzim endonuklease restriksi tipe II telah diidentifikasi di dalam bakteri yang berbeda. Setiap enzim dinamai dari mana bakteri itu diisolasi menggunakan sistem penamaan yang didasarkan genus bakterial, spesies, dan strain. Sebagai contoh, nama enzim restriksi EcoRI diturunkan sbb;

Tata Nama Singkatan Arti Deskripsi E Escherichia genus Co coli spesies R RY13 strain I diidentifikasi pertama urutan identifikasi di dalam bakteri tersebut

PLASMID Pada beberapa jasad, terutama pada kelompok prokariot, seringkali dijumpai bahan genetik tambahan selain bahan genetik utama yang ada dalam kromosom . Bahan genetik tambahan/ekstra semacam ini secara umum disebut plasmid

PLASMID Plasmid pada prokariot berupa molekul DNA untai ganda dengan struktur lingkar (circular). Pada umumnya plasmid tidak dibutuhkan oleh sel untuk pertumbuhan meskipun seringkali plasmid membawa gen-gen tertentu yang memberikan keuntungan tambahan bagi sel dalam keadaan tertentu, misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik, ketahanan terhadap logam berat, dsb.

Plasmid dapat dihilangkan tanpa mengganggu pertumbuhan Dalam keadaan normal plasmid dapat dihilangkan dengan metode kuring tanpa mengganggu perumbuhan selnya.

Plasmid ada dimana ? Plasmid berada bebas di dalam sitoplasma dan pada umumnya bereplikasi secara independen (tidak tergantung DNA inti sel).

Berapa Jumlah Copy Plasmid ? Jumlah turunan (copy number) plasmid di dalam suatu sel bervariasi dari satu copy sampai beberapa ratus kopi. plasmid seri pUC, dapat diperbanyak jumlahnya di dalam E.coli sehingga dapat mencapai jumlah turunan sampai lebih dari seribu copy per sel.

Ukuran Plasmid Ukuran plasmid sangat bervariasi tetapi pada umumnya lebih kecil dari ukuran bahan genetik utama (kromosom) sel prokariot.

PLASMID: ada yg alami, ada pula yg artifisial Pada dasarnya plasmid merupakan entitas genetik yang diketemukan secara alami di dalam sel beberapa kelompok prokariot dan eukariot Alami

PLASMID: ada yg alami, ada pula yg artifisial Dengan teknik rekayasa genetik, sekarang telah dapat dikembangkan plasmid artifisial dengan cara menggabungkan gen-gen dari beberapa plasmid alami maupun dari genom jasad tertentu. Salah satu contoh plasmid artifisial adalah plasmid seri pUC, misalnya pUC 18 dan pUC 19 , dan juga plasmid pBR322. Artifisial

Plasmid pUC18/19

Plasmid pBR322 mengandung dua gen resitensi/ ketahanan terhadap: 1 Plasmid pBR322 mengandung dua gen resitensi/ ketahanan terhadap: 1. antibiotik ampisislin , ampr 2. Antibiotik tetrasiklin, tetr Artinya apabila suatu bakteri dalam sitoplasmanya terdapat plasmid pBR322 ini maka bakteri itu akan bisa bertahan hidup dalam media yang mengandung ampisilin ataupun tetrasiklin. Sedangkan bakteri yang tidak mengandung plasmid ini maka akan mati jika berada di dalam media yg mengandung antibiotik tersebut.

Dalam keadaan normal, kehadiran plasmid pada umumnya tak diperlukan oleh sel. Dalam keadaan tertentu misalnya dalam media yg mengandung antibiotik, maka diperlukan plasmid oleh bakteri untuk mempertahankan hidupnya dengan menggunakan gen ketahanan antibiotik yg ada dalam plasmid.

CONTOH PLASMID ARTIFISIAL HASIL REKAYASA

Sifat plasmid pBR 322 Relatif kecil dengan berat molekul 2,6x106 Telah diketahui urut-urutan nukleotidanya 4362 secara komplit Mempunyai sisi pemutus tunggal untuk PstI, SalI, EcoRI,HindIII,BamHI Mempunyai 2 penanda resistensi ( ampicillin dan tetrasiklin)

Plasmid dipotong dengan enzim endonuklease restriksi tertentu Rekombinasi Plasmid dengan Gen Asing (Gen yang disisipkan) Plasmid dipotong dengan enzim endonuklease restriksi tertentu DNA Kromosom juga dipotong dengan enzim endonuklease restriksi yang sama Hasil potongan keduanya disambungkan, maka akan diperoleh plasmid rekombinan yaitu plasmid yang telah tersisipi potongan DNA (gen) sel donor Plasmid rekombinan ditransformasikan ke dalam sel inang, misalnya E. coli.

Bagian mana dari plasmid yg dipotong? Urutan DNA plasmid sudah tertentu sehingga dapat dikenali dan dipotong dengan enzim endonuklease tertentu . Misalnya plasmid pBR322 akan terpotong oleh enzim PstI pada daerah gen ketahanan terhadap ampisilin(ampr). Pemotongan plasmid pada daerah ini akan menyebabkan kerusakan gen ketahanan terhadap ampisilin tersebut . Bakteri yg membawa plasmid yg telah terpotong pada gen ampr tidak lagi tahan dalam media yg mengandung ampisilin

Rekombinasi Plasmid dengan Gen Asing (Gen yang disisipkan)

Identifikasi Bakteri Pembawa Plasmid Rekombinan

Seleksi dg Antibiotik Sel 1 dan sel 2 tahan thd tetrasiklin: membawa plasmid dg gen tetr Masih utuh Sel 2 gen tetr utuh tetapi gen ampr telah rusak sehingga tidak tahan ampisilin Sel 1 gen tetr dan gen ampr utuh semuanya. Sehingga tahan ampisilin

Transformasi Gen dengan Plasmid pUC18/19

PLASMID pUC 18/19

Enzim Beta Galaktosidase

5-bromo- 4-dikloro-indol-b_D-Galaktosidase

SOAL QUIZ 1 a) Definisikan “ Bioteknologi “ b) Apa yang membedakan Bioteknologi konvensional dan Bioteknologi modern/molekuler

Lanjutan Soal Quiz 1 2. Jika kloning gen ke dalam suatu bakteri menggunakan plasmid pBR322. Baik plasmid maupun DNA sumber gen donor dipotong dg enzim PstI . Jelaskan bagaimana cara membedakan bakteri yg membawa plasmid rekombinan dan bakteri yang membawa plasmid asli/ utuh.

3. Dari transkripsi DNA berikut, anda diminta 3. Dari transkripsi DNA berikut, anda diminta menggambarkan urutan mRNA hasil transkripsi yang berbentuk struktur batang dan lengkungan (loop) sebagai pertanda transkripsi segera diakhiri

4. Jelaskan kenapa enzim endonuklease restriksi tipe 2 banyak digunakan untuk memotong gen dalam bioteknologi modern. Berikan contohnya.