TEKNOLOGI TRANSPLANTASI SEL TESTIKULAR DALAM REKAYASA PRODUKSI TELUR IKAN NILEM MELALUI INDUK PENGGANTI DARI IKAN MAS Ujang Subhan Mimpi yang Harus Jadi Kenyataan sebagai Wujud Kreasi Anak Negeri

Rainbow trout juveniles produced by surrogated masu salmon In this study, we concluded that ‘Live offspring derived from xenotransplanted germ cells were successfully produced for the first time in vertebrates.’ This is a recent picture of young rainbow trouts yielded from surrogated yamame salmon. They are growing up in good health. Donor-derived offspring from inter-species germ-cell transplantation were successfully produced (Takeuchi et al. 2004, Nature) Goro Yoshizaki: Simposium Bioteknol. Akuakul., ICC IPB-Bogor, 14 Agustus 2008.

spermatogonia spermatocyte sperm Primordial Germ Cells oogonia oocyte egg Primordial Germ Cell Sex differentiation 20　mm spermatogonia spermatocyte sperm Goro Yoshizaki: Simposium Bioteknol. Akuakul., ICC IPB-Bogor, 14 Agustus 2008.

spermatogonia spermatocyte sperm Spermatogonial stem cells oogonia oocyte egg Primordial Germ Cell Sex differentiation 20　mm spermatogonia spermatocyte sperm Goro Yoshizaki: Simposium Bioteknol. Akuakul., ICC IPB-Bogor, 14 Agustus 2008.

Donor-derived offspring from spermatogonial transplantation In this study, we concluded that ‘Live offspring derived from xenotransplanted germ cells were successfully produced for the first time in vertebrates.’ This is a recent picture of young rainbow trouts yielded from surrogated yamame salmon. They are growing up in good health. Donor-derived offspring from spermatogonial transplantation (Okutsu et al. 2007, Science)

Ikan Nilem Ikan Mas Ukuran induk 200 g > 1500 g Fekunditas sedikit Fekunditas 25% dari bobot tubuh

Ikan mas sebagai Induk pengganti Telur dapat diproduksi lebih banyak Produksi telur lebih terjamin Lebih menguntungkan Industri Kapiar

Tujuan Penelitian: Spermatogonia Jantan Betina recipients Donor telur Donor sperma Baby fish Benih nilem

Penelitian pendukung: Langkah Penelitian: Karakterisasi sel germinal testis ikan nilem Menentukan metode disosiasi sel germinal Analisi kolonisasi sel germinal testis ikan nilem pada gonad ikan mas (ikan resepien) Penelitian pendukung: cDNA cloning and expression analysis of vasa-like gene pada ikan nilem Marker DNA pada sel gonadal dengan metode PCR

1. Characterization of testicular germ cells in giant gouramy Spermatogonia Goro Yoshizaki: Simposium Bioteknol. Akuakul., ICC IPB-Bogor, 14 Agustus 2008.

Testis Testis dari ikan gurame ukuran 800 g Vas deferens 20 µl spermatosit spermatogonia spermatid Spermatogonia-B Spermatogonia-A Spermatosit Spermatid Sel testikular hasil disosiasi Histologi testis, pewarna HE

2. Larutan disosiasi yang digunakan Tujuan penggunaan larutan disosiasi: diperoleh banyak sel spermatogonia dan viabel/hidup Dua jenis larutan disosiasi: 1. Trypsin-phosphate buffer saline (Tryp-PBS) 2. Trypsin-phosphate buffer saline/fetal bovine serum/DNase I (Tryp-PBS/FBS/DNase) Lama inkubasi: 1, 2, 3, 4 dan 5 jam, Suhu ruang, Trypan blue. Sel testikular ikan gurame hasil disosiasi. Tanda panah garis penuh: sel yang viabel; tanda panah garis putus: sel yang mati. Contoh hasil disosiasi pada ikan gurame

Jumlah dan viabilitas sel testikular ikan gurame hasil disosiasi. Larutan disosiasi Lama inkubasi (jam) Jumlah sel Viabilitas sel (%) Tryp-PBS 1 515.555 ± 134.219 100,00 0,00   2 662.222 174.016 96,77 3,23 3 573.334 300.222 91,87 8,66 4 577.778 84.678 93,70 2,07 5 680.000 18.856 90,79 1,86 Tryp-PBS/ 302.222 131.543  FBS/DNase 484.445 180.041 98.24 3,04 568.889 250.274 94,95 5,28 471.111 116.492 95,29 5,74 1.520.000 207.846 87,84 1,74 Kesimpulan: Kedua larutan disosiasi bisa digunakan Lama inkubasi ≤ 2 jam

3. Analisis sel donor pada ikan recipient Tujuan: Sel donor dapat terkolonisasi dalam individu resipien? Umur resipien saat transplantasi mempengaruhi persentase kolonisasi sel donor? Sel donor hasil disosiasi menggunakan kedua larutan disosiasi dapat terkolonisasi? Tahapan: Pengembangan metode identifikasi sel donor dalam individu ikan resipien Transplantasi sel donor dan pemeliharaan ikan hasil transplantasi Analisis kolonisasi

3.1. Metode identifikasi sel donor dalam individu resipien: Sel donor berlabel gen berpendar, green fluorescent protein (GFP); ikan transgenik Injeksi mRNA GFP-vasa Sel dilabel PKH26 (sel berwarna merah) PCR, metode alternatif bila warna PKH26 hilang setelah ikan matang gonad Penelitian Strategis Internasional, DIPA IPB No.: 50/13.24.4/SPK/BG-PSN/2009

Testes of vasa-GFP trout 精原幹細胞の移植方法です。 本実験では、緑色蛍光で標識された生殖細胞を持つvasa-GFP遺伝子導入ニジマスの ９～１０ヶ月齢、雄個体をドナーとしました。 ドナーより摘出した精巣をトリプシンで解離し、こちらのような精巣細胞懸濁液を得ました。 この懸濁液中には、大量の精原幹細胞が含まれていると考えられます。 これをガラスマイクロピペットに吸引します。 こちらは、およそ15,000細胞を含む懸濁液を吸引したピペットです。 懸濁液中の生殖細胞が緑色蛍光を発していることが確認できます。 続いて、ピペットに吸引した懸濁液を、宿主である野生型ニジマス孵化稚魚の腹腔内へ 顕微注入し、精原幹細胞の移植を行いました。 移植後、適時、宿主個体の解剖観察を行い、 宿主生殖腺内におけるドナー生殖細胞の追跡を行いました。 その結果、移植10日後までは、 宿主生殖腺内に取り込まれたドナー生殖細胞は確認されませんでした。 Testes of vasa-GFP trout Recipient (non-tg) Intraperitoneal transplantation Testicular cell suspension Goro Yoshizaki: Simposium Bioteknol. Akuakul., ICC IPB-Bogor, 14 Agustus 2008.

3.1. Metode identifikasi sel donor dalam individu resipien: Sel donor berlabel gen berpendar, green fluorescent protein (GFP); ikan transgenik Injeksi mRNA GFP-vasa Sel dilabel PKH26 (sel berwarna merah) PCR, metode alternatif bila warna PKH26 hilang setelah ikan matang gonad  Penelitian Strategis Internasional, DIPA IPB No.: 50/13.24.4/SPK/BG-PSN/2009

Persentase sel berlabel Cell labeling using PKH26 (Sigma): Disosiasi sel testikular : tripsin 0,5% dalam PBS selama 2 jam Dosis PKH26 : 2 µl / 200 μl Lama inkubasi (menit) Persentase sel berlabel (%) 5 28,57 10 50,00 20 81,25 

3.2. Transplantasi Jarum mikroinjeksi Jarum mikroinjeksi Umur resipien vs. kelangsungan hidup benih ikan nila hasil transplantasi Sel donor hasil disosiasi dengan larutan berbeda vs. kelangsungan hidup benih ikan hasil transplantasi, dan Persentase kolonisasi Jarum mikroinjeksi Jarum mikroinjeksi

Jumlah ikan awal (ekor) Jumlah ikan akhir*) (ekor) Kelangsungan hidup benih ikan nila hasil transplantasi dan kontrol Metode disosiasi Umur larva (hari) Jumlah ikan awal (ekor) Jumlah ikan akhir*) (ekor) SR (%) Tryp-PBS 2 17 11 64,71 3 20 12 60,00 7 5 71,43 10 6 Tryp- 1 15 66.67 PBS/FBS/ 8 53,33 DNase 13 65,00 4 21 14 66,67 9 75,00 Kontrol 40,00 100,00 70,00 Kelangsungan hidup ikan hasil transplantasi relatif sama

3.3. Analisis kolonisasi sel donor dalam individu resipien Kontrol Transplantasi Tanpa filter Filter merah Penelitian Strategis Internasional, DIPA IPB No.: 50/13.24.4/SPK/BG-PSN/2009

Persentase kolonisasi sel donor ikan gurame dalam gonad ikan nila Metode disosiasi Umur larva (hari) Jumlah ikan diperiksa (ekor) Persentase kolonisasi Estimasi jumlah sel terkolonisasi Tryp-PBS 2 4 25 38 3 NA 5 6 Tryp-PBS/ 1 FBS/DNase 50 28 ; 55 75 47; 50; 91 100 banyak NA: belum dianalisis Kesimpulan: Sel spermatogonial ikan gurame dapat terkolonisasi dalam gonad ikan nila Kedua larutan disosiasi dapat digunakan dalam disosiasi sel testikular untuk transplantasi

NEGERI YANG BERMARTABAT TERIMA KASIH & SELAMAT BERKARYA UNTUK NEGERI YANG BERMARTABAT