Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

KCKT atau HPLC

Kromatografi Kolom Terbuka Color Sistem pemasukan sampel: manual, tidak volumetrik  Injector Waktu analisis lama, mengandalkan gaya grafitasi dan kapiler  pompa Hasil pemisahan kurang baik  pengemasan kolom Kesulitan Pengamatan hasil pemisahan untuk analit tidak berwarna  Detektor Kesulitan penghitungan kadar  integrator

KCKT dikembangkan dari kromatografi kolom terbuka untuk menjawab kekurang-kekurangan tersebut  Injector: Sistem pemasukan sampel: sample loop dan robotik injektor, sangat volumetrik  Pompa: Waktu analisis singkat, pengulangan/presisi baik  Kolom: baja, packing kompak, partikel sangat kecil, tekanan dapat dibuat besar  Hasil pemisahan baik  Detektor: semua zat dapat diamati (tidak harus berwarna)  Integrator: dilengkapi komputer  mudah penghitungan kadar  Sehingga disebut: Kinerja Tinggi

Kelebihan KCKT 1. isolasi zat tidak mudah menguap 2. isolasi zat yang secara termal tidak stabil 3. pemisahan senyawa-senyawa anorganik 4. dapat dioperasikan pada suhu kamar

Perbedaan KCKT dibandingkan dengan kolom biasa

BAGAN SISTEM KCKT pompa injektor kolom detektor Wadah solven integrator

WADAH FASE GERAK Merupakan tandon berisi fase gerak Mempunyai sistem penyaring pompa injektor kolom detektor Wadah solven integrator

Fasa Gerak

POMPA Merupakan sistem agar fase gerak mengalir. Kinerja pompa yang diinginkan : Tekanan yang dihasilkan tinggi Fluktuasi tekanan rendah Kecepatan aliran fase gerak tepat pompa injektor kolom detektor Wadah solven integrator

POMPA  Laju alir normal biasanya 1 – 2 ml/menit  Pompa dapat mengalirkan fase gerak secara isocratic (komposisi dan laju alir tetap) atau dengan secara gradient (komposisi dan laju alir berubah berdasarkan pengaturan waktu)

Column Pump [LOAD] [INJECT] INJEKTOR: Alat untuk pemasukan sampel ke dalam sistem KCKT pompa injektor kolom detektor Wadah solven integrator

kolom posisi load Posisi inject pompa kolom sample loop Sistem sample loop injektor

Kolom pada KCKT  Penampang: baja tahan karat, tahan tekanan tinggi  Ukuran partikel sangat kecil: pengepakan lebih kompak, hasil pemisahan lebih baik  Dapat dipakai berulang

Kolom dari stainless steel

Yang umum dipakai Detektor Ultraviolet / Visible (UV/VIS) Detektor Photodiode Array (PDA) Detektor Fluorescence (RF) Detektor Konduktivitas (CDD) Detektor Refraktive Indeks (RID) Detektor Elektrokimia (ECD) Detektor spektrometer massa DETEKTOR HPLC pompa injektor kolom detektor Wadah solven integrator

E in A  Cl  = - log (E out / Ein) l Hk.Lambert-Beer kuvet DETEKTOR SPEKTROFOTOMETER UV/VIS E out Prinsip: penyerapan sebagian energi (hv) oleh molekul pada panjang gelombang tertentu => tereksitasi elektronik Eksitasi elektronik

A  Cl  = - log (E out / Ein) absorbansi konsentrasi Kisaran linear 1

275 nm 208 nm 275 nm 208 nm Pemilihan pjg gelb.: quantitative / preparative?

Detektor Photodiode Array Sample Cell 512 Elements Photodiode Array Grating D2 / W lamp satu elemen dapat Mendeteksi absorban Pada satu pjg gelb..

Detektor Photodiode Array : Kromatogram 3D waktu Panjang gelb. Absorban si kromatogram Spektrum

Detektor Photodiode Array Puncak dapat di identifikasi dengan spektrum UV. Pemeriksaan kemurnian puncak dapat dilakukan. --overlap 3 spektrum --rasio kromatogram --perbandingan threshold dan similarity index.

Detektor Spektrofluoresen + h 1 h 2 + * A A*A* A h 1 h 2 Excitation Wavelength Emission Wavelength Fluorescence *

Rancangan Cell untuk detektor Fluorescence

Reagen derivatisasi Reagen OPA untuk amine primer Reagen ADAM untuk asam lemak CHN2 9-anthryldiazomethane (ADAM) + R-COOH CH2OCOR CHO o-phthalaldhyde (OPA) + R-NH2 N-R A A

Detektor Refraktive Indeks Sistem optik

Detektor Refraktive Indeks

Kromatogram gula Analytical Conditions  Column : Shim-pack CLC- NH2  Mobile phase : Acetonitrile / water = 7 / 3  Flow rate : 1.0 mL/min  Temperature : Ambient Peaks 1. Glycerol 2. Xylose 3. Fructose 4. Glucose 5. Sucrose 6. Manose 7. Lactose BAGIAN DARI SISTEM HPLC

Detektor Konduktifitas I V L AA K (conductivity) = I [A] / E [V] =A [cm2] / L [cm] * k (k : specific conductivity) k= (I/E)*(L/A) elektroda

Detektor Konduktifitas Konduktifitas sangat dipengaruhi temperatur. Cell harus diletakkan pada kondisi temperatur terkontrol

Kromatogram anion dalam air laut Analytical Conditions  Column : Shim-pack IC-A3  Mobile phase : 8.0 mM p-hydroxybenzoic acid 3.2 mM Bis-Tris *  Flow rate : 1.5 mL/min  Temperature : 40 C  Injection Volume : 100 uL Peaks  1. F (1.4 ppm)  2. Cl (10200 ppm)  3. NO2 (10 ppm)  4. Br (43 ppm)  5. NO3 (44 ppm)  6. SO4 (431 ppm) Bis-Tris : bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane

Perbandingan detektor LOD : Limit deteksi (S/N=3) GC : Gradient Compatibility

Hasil Analisis dengan menggunakan HPLC