Validasi & Verifikasi Metode Dan Keabsahan Hasil Pengujian Mikrobiologi Agens Pengendali Hayati (APH).

OUTLINE Pendahuluan Metode Pengujian Validasi dan Verifikasi Metode Parameter Validasi dan Verifikasi Metode Protokol Verifikasi – Validasi Metode sesuai ISO 16140

Pendahuluan Laboratorium Penguji Menghasilkan data hasil uji laboratorium yang andal dan absah

CRM, SRM, Kontrol positif dan negatif AKURASI ANDAL PRESISI HASIL ANALISIS ABSAH TERTELUSUR KE SI (TRACEABLE TO SI) CRM, SRM, Kontrol positif dan negatif

Keandalan/ Reliabilitas Data Presisi rendah Keandalan/ Reliabilitas Data Akurasi : kedekatan hasil analisis terhadap nilai sebenarnya akurasi  mendapat nilai benar Presisi : kedekatan antara sekumpulan hasil analisis Presisi  mendapat nilai yang sama Reliabilitas data merupakan ∑ akurasi & presisi Andal  mendapat nilai yang sama dan nilai tersebut benar  akurasi dan presisi sangat baik Presisi tinggi akurasi & presisi tinggi Reliabilitas data ≠ Akurasi ≠ Presisi

AKURASI DAN PRESISI Secara kualitatif, perbedaan antara akurasi dan presisi hasil analisis digambarkan sbb:  Akurasi tinggi Presisi tinggi   Akurasi tinggi Presisi rendah                 Akurasi rendah Presisi rendah  Akurasi rendah Presisi tinggi        

METODE PENGUJIAN Harus menyesuaikan jaman dan perkembangan teknologi Dapat ditetapkan sebagai standar, dan atau didukung oleh data validasi/verifikasi Ditunjang oleh data kinerja untuk menunjukkan kompetensi laboratorium Dapat diikuti dengan tepat dan mendapat hasil yang akurat

Ada 2 jenis metode pengujian Metode yang sudah divalidasi dan diakui oleh badan/organisasi metode internasional metode yang baru dipublikasikan metode standar yang dimodifikasi METODE BAKU/ STANDAR METODE TIDAK BAKU/ NON STANDAR

Metode tidak baku Metode Baku * Metode yang dirancang, diuji coba, dan divalidasi secara luas oleh suatu laboratorium sehingga metode tersebut dapat dipercaya dan memberikan hasil yang akurat * Metode karya orisinil laboratorium tertentu * Metode hasil modifikasi dari metode lainnya (Metoda standar, resmi atau pustaka) Standar Nasional Indonesia (SNI) International organization for standarization/ISO Bacteriological Analytical Manual /BAM Farmakope Indonesia

Metode Pengujian Jenis Validasi Metode Validasi Primer Validasi Sekunder (Verifikasi Metode)

Validasi Primer Proses pembuktian atau konfirmasi pengujian yang obyektif di laboratorium, untuk menunjukkan bahwa metode itu memenuhi persyaratan yang telah ditentukan, yang sesuai dengan tujuan penggunaannya/sesuai untuk diterapkan oleh laboratorium pengguna Tujuannya :  Agar data hasil uji laboratorium valid  Untuk mengurangi/memperkecil terjadinya kesalahan dalam pengujian

Validasi Sekunder Uji kinerja metode standar sebelum dijadikan metode pengujian rutin Untuk memastikan bahwa laboratorium/personel lab dapat menerapkan metode standar untuk pengujian rutin dengan baik (ketersediaan alat, fasilitas, pereaksi, penguji, ketrampilan dan kompetensi) sehingga dapat menjamin mutu hasil pengujiannya (hasil yang dapat dihandalkan/valid)

Kapan metode perlu divalidasi /verifikasi Pertama kali menggunakan metode atau mengidentifikasi organisma yang sebelumnya tidak diuji Mengganti metode uji dengan yang baru (reagen/media baru, alat/ teknologi baru) Menambah ruang lingkup matrik sampel

Validasi Metode dilakukan jika: Metode tidak baku Metode yang didesain/dikembangkan laboratorium Metode baku yang dimodifikasi Metode baku tapi berbeda matriks sampel Metode diterbitkan dalam majalah ilmiah, informasi cukup jelas Metode baku yang digunakan di luar ruang lingkupnya

Mengapa metode standar harus diverifikasi? Lab harus meyakinkan bahwa metode standar dapat diterapkan terhadap jenis sampel yang diuji Lab perlu menentukan spesifisitas metode standar Lab dapat mengetahui masalah yang timbul dalam menerapkan metode standar Lab dapat mengetahui unjuk kerja analis dalam melakukan pengujian dengan metode standar Lab dapat menunjukkan pengujian dilakukan dengan benar Lab memenuhi persyaratan ISO 17025 (akreditasi lab)

Parameter Validasi dan Verifikasi Metode Validasi Metode Presisi (AOAC, USP, Sac-Singlas) False Positive and False Negative (relative, ISO) Akurasi (relative, ISO, AOAC, USP, Sac-Singlas) Specificity (relative, ISO) Sensitivity (relative, ISO) Limit of detection (ISO, AOAC, USP) Limit of quanitification (ISO, AOAC, USP) Linearitas (ISO, AOAC, USP) Ketangguhan metode (ISO, AOAC, USP) Akurasi (relative, ISO, AOAC, USP, Sac-Singlas) Presisi (AOAC, USP, Sac-Singlas) Sensitivitas / limit deteksi (relative, ISO) Spesifisitas (relative, ISO) False Positive and False Negative (relative, ISO)

Akurasi: Validasi dan Verifikasi Metode menunjukkan kedekatan hasil pengukuran terhadap nilai sebenarnya mengukur kesesuaian antara hasil dan nilai sebenarnya, menggambarkan systematic error (kesalahan sistematik atau bias) akurasi dapat ditentukan melalui standar adisi

- Akurasi menggunakan standar adisi : Bagian dari teknik analisis kuantitatif dengan cara menambahkan mikroorganisme target dengan jumlah yang telah diketahui ke dalam sampel Spiking mungkin berguna bila lab sulit untuk mendapatkan contoh uji alami yang mengandung mikroorganisme target akurasi nilai benar konsentrasi mikroba yang ditambahkan (spike) pada matriks sampel

Akurasi : Pendekatan untuk mengetahui akurasi : a. Uji Rekoveri : persen perolehan kembali konsentrasi mikroba yang ditambahkan/spike pada matriks sampel Recovery (%) = H x 100% A Galat Relatif : (H-A) x 100% Keterangan : H : hasil pengujian dengan metode A : hasil sebenarnya dari mikroba target

Uji Rekoveri Relatif : persen perolehan kembali dari metode yang diverifikasi dan metode baku/standar  Rekoveri Relatif = H x 100% B H : hasil pengujian metode yang diverifikasi A : hasil pengujian metode standard

Presisi Kedekatan diantara beberapa individu hasil pengujian (seberapa dekat pengamatan yang satu dengan yang lainnya) Presisi menunjukkan tingkat kesesuaian antara beberapa hasil pengujian individu dengan hasil rata-rata pengujian berulang pada sampel yang homogen dengan kondisi pengujian yang sama Menggambarkan random error (kesalahan acak) Nilai presisi biasanya dinyatakan dalam bentuk nilai RSD (relative standard deviation)

PRESISI Presisi adalah tingkat kedekatan hasil uji diantara individu dalam suatu pengujian Presisi terdiri dari Keterulangan (Replikasi, Repeatability) Ketertiruan (Reproducebility) Keseksamaan antara (Intermediet precision)

Pendekatan presisi (variasi pengukuran hasil uji independen yang diperoleh ) Replikasi : metode, pelaksana, waktu, sampel, alat, laboratorium  sama Repeatability: metode, pelaksana, sampel, alat, laboratorium sama, waktu beda

Reproducibility : intra (dalam satu lab) : sampel, metode dan alat sama, pelaksana yang berbeda, waktu bisa sama atau beda (rentang waktu tidak lama) inter (berbeda lab) : sampel dan metode sama, pelaksana dan alat beda, waktu bisa sama atau beda (rentang waktu tidak lama)

Protokol Verifikasi – Validasi Metode sesuai ISO 16140

Validasi/Verifikasi Metode mengacu pada: ISO 16140 Validasi/ Verifikasi Metode, mencakup : Penyiapan sampel Jumlah sampel Kontaminasi sampel Parameter verifikasi Syarat keberterimaan

Pastikan: Prioritas metode yang akan divalidasi/verifikasi Jadwal validasi/verifikasi Personel yang terlatih Peralatan menunjukkan kinerja yang baik dan terkalibrasi Mikroorganisme target atau acuan Lingkungan yang memenuhi persyaratan Media dan reagensia tidak kadaluarsa dan mempunyai kinerja yang baik dan pH sesuai Program statistik untuk menghitung, mengevaluasi dan menginterpretasikan hasil pengujian kuantitatif

Pemilihan sampel Sampel mewakili jenis yang secara rutin diuji oleh lab (matrik) Gunakan sampel natural, sampel yang terkontaminasi secara alami dengan mikroba yang diuji (jika mungkin) Jika tidak mungkin mendapatkan jumlah yang cukup untuk sampel yang terkontaminasi secara alami pada tingkat yang diperlukan, diperbolehkan untuk mencemari secara artifisial (spike) Pertimbangkan untuk melakukan duplikat atau replikat secara independent dengan menyiapkan sub-sample, sesuai dengan yang ditentukan ISO 16140

Pemilihan mikroorganisma Sumber/asal: sebaiknya tertelusur Dapat menggunakan mikroorganisma yang diisolasi dari sampel Strain tipikal atau dapat juga yang atipikal Mikroba pesaing