SINTESIS PROTEIN Drs. Sutarno, MSc.PhD

Aliran informasi genetik Dna sbg penyimpan utama informasi genetik dlm sel Masing2 heliks ganda DNA berperan sbg template/ cetakan untuk replikasinya sendiri Replikasi mendahului semua pembelahan sel, mrpkn cara ditransmisikannya/ diwariskannya informasi genetik kpd sel keturunannya. RNA selluler disintesis dr cetakan DNA melalui proses transkripsi. Hanya satu untai DNA yg berperan sbg cetakan dlm sintesis RNA Gen disebut aktif/terekspresi jika ditranskripsikan mjd RNA Protein disintesis dr cetakan mRNA melalui proses translasi. Aliran informasi genetik ini sering disebut: Dogma Sentral Biologi Molekuler.

DNA rRNA mRNA tRNA T R A N S L A S I Protein Alur informasi yang melibatkan DNA, RNA dan Protein di dalam sel (Dogma sentral Biologi Molekuler) DNA T R A N S K R I P S I rRNA mRNA tRNA Ribosom T R A N S L A S I Protein

Dua langkah utama dalam sintesis protein: transkripsi translasi

Dogma sentral dalam Biologi molekuler Arah informasi (kecuali reverse transkripsi) adalah dari DNA ke RNA melalui proses transkripsi, dan kemudian pembentukan protein melalui translasi. Transkripsi adalah pembentukan molekul RNA dari DNA. Translasi adalah penyusunan protein dari sekuen asam amino (polypeptide) berdasarkan kode yang dibawa mRNA.

Dogma sentral dalam Biologi molekuler

Perangkat yg diperlukan dalam sntesis protein Ribosom Enzym Messenger RNA (mRNA) is the blueprint for construction of a protein. Ribosomal RNA (rRNA) is the construction site where the protein is made. Transfer RNA (tRNA) is the truck delivering the proper amino acid to the site at the right time.

tRNA

Transkripsi Transcription: making an RNA copy of a DNA sequence RNA polymerase opens the part of the DNA to be transcribed. Only one strand of DNA (the template strand) is transcribed.

1. Inisiasi proses Transkripsi RNA polymerase dapat mengenali sisi awal dari suatu gen, dengan demikian enzim ini mengetahui dimana harus memulai mensintesis mRNA. Daerah awal pengenalan berupa sekuen DNA khusus yang berada pada sekuen awal suatu gen yang disebut dengan promoter. Ini mrpkn suatu sekuen unidirectional (satu arah) pada satu strand DNA yang memberitahu RNA polymerase tempat mulai serta arah (pada strand mana) sintesis.

  2. Elongation (pemanjangan) Transkripsi RNA polymerase kemudian menambahkan nukleotida untuk memperpanjang rantai mRNA yang komplemen dengan strand DNA. RNA polymerase menempatkan rNTPs (ribonucleic nucleotides triphosphates) dengan cara yang sama seperti yang dilakukan DNA polymerase dalam mengambi dan menempatkan dNTPs. Namun demikian, karena sintesis ini hanya berlangsung dalam untai tunggal dan hanya berlangsung dalam arah 5' ke 3‘, maka tidak perlu adanya fragmen Okazaki. Penting untuk diketahui bahwa sintesis RNA ini berlangsung dalam satu arah (unidirectional)

3. Termination (pemberhentian) Transkripsi Berakhirnya polimerisasi RNA ditandai oleh disosiasi kompleks transkripsi atau terlepasnya enzim RNA polimerase beserta kofaktor-kofaktornya dari untai DNA cetakan. Begitu pula halnya dengan molekul RNA hasil sintesis. Hal ini terjadi ketika RNA polimerase mencapai urutan basa tertentu yang disebut dengan terminator.

Terminasi transkripsi dapat terjadi oleh dua macam sebab, yaitu terminasi yang hanya bergantung kepada urutan basa cetakan (disebut terminasi diri) dan terminasi yang memerlukan kehadiran suatu protein khusus (protein rho). Di antara keduanya terminasi diri lebih umum dijumpai. Terminasi diri terjadi pada urutan basa palindrom yang diikuti oleh beberapa adenin (A). Urutan palindrom adalah urutan yang sama jika dibaca dari dua arah yang berlawanan. Oleh karena urutan palindom ini biasanya diselingi oleh beberapa basa tertentu, maka molekul RNA yang dihasilkan akan mempunyai ujung terminasi berbentuk batang dan kala (loop

Inisiasi transkripsi tidak harus menunggu selesainya transkripsi sebelumnya. Hal ini karena begitu RNA polimerase telah melakukan pemanjangan 50 hingga 60 nukleotida, promoter dapat mengikat RNA polimerase yang lain. Pada gen-gen yang ditranskripsi dengan cepat reinisiasi transkripsi dapat terjadi berulang-ulang sehingga gen tersebut akan terselubungi oleh sejumlah molekul RNA dengan tingkat penyelesaian yang berbeda-beda.

RNA Processing RNA Processing: pre-mRNA --> mRNA Semua transkrip primer yang dihasilkan di dalam nukleus, harus mengalami taham pemrosesan untuk menghasilkan molekul RNA yang fungsional untuk dikeluarkan ke sitoplasma.

RNA processing merupakan proses untuk menghasilkan RNA yang dewasa (mature mRNA) bagi gen protein, atau tRNA / rRNA fungsional dari primary transcript.  Pemrosesan pre-mRNA meliputi tahap-tahap: Capping – penambahan 7-methylguanylate (m7G) ke ujung 5’ Polyadenylation - penambahan poly-A ke ujung 3‘. Splicing – pembuangan intron dan menggabungkan/ menyambungkan exon.

The procedure of RNA processing for protein genes.

5'-Capping Cap site: Two usages: In eukaryotes, the cap site is the position in the gene at which transcription starts, and really should be called the "transcription initiation site". The first nucleotide is transcribed from this site to start the nascent RNA chain. That nucleotide becomes the 5' end of the chain, and thus the nucleotide to which the cap structure is attached (see "Cap"). In bacteria, the CAP site (note the capital letters) is a site on the DNA to which a protein factor (the Catabolite Activated Protein) binds. Capping occurs shortly after transcription begins.   The chemical structure of the "cap" is shown in the following figure, where m7G is linked to the first nucleotide by a special 5'-5' triphosphate linkage.  In most organisms, the first nucleotide is methylated at the 2'-hydroxyl of the ribose.  In vertebrates, the second nucleotide is also methylated.

5’-capping, Modifications at the 5' end.

3'-Polyadenylation A stretch of adenylate residues are added to the 3' end.  The poly-A tail contains ~ 250 A residues in mammals,  and ~ 100 in yeasts. Polyadenylation at the 3' end.  The major signal for the 3' cleavage is the sequence AAUAAA.  Cleavage occurs at 10-35 nucleotides downstream from the specific sequence.   A second signal is located about 50 nucleotides downstream from the cleavage site.   This signal is a GU-rich or U-rich region.

RNA splicing RNA splicing is a process that removes introns and joins exons in a primary transcript.  An intron usually contains a clear signal for splicing (e.g., the beta globin gene).  In some cases (e.g., the sex lethal gene of fruit fly), a splicing signal may be masked by a regulatory protein, resulting in alternative splicing.  In rare cases (e.g., HIV genes), a pre-mRNA may contain several ambiguous splicing signals, resulting in a few alternatively spliced mRNAs. Splicing signal Most introns start from the sequence GU and end with the sequence AG (in the 5' to 3' direction).  They are referred to as the splice donor and splice acceptor site, respectively.  However, the sequences at the two sites are not sufficient to signal the presence of an intron.  Another important sequence is called the branch site located 20 - 50 bases upstream of the acceptor site.   The consensus sequence of the branch site is "CU(A/G)A(C/U)", where A is conserved in all genes. In over 60% of cases, the exon sequence is (A/C)AG at the donor site, and G at the acceptor site. Figure 5-A-4.  The consensus sequence for splicing.  Pu = A or G; Py = C or U. 

Splicing mechanism The detailed splicing mechanism is quite complex.  In short, it involves five snRNAs and their associated proteins.  These ribonucleoproteins form a large (60S) complex, called spliceosome.  Then, after a two-step enzymatic reaction, the intron is removed and two neighboring exons are joined together. The branch point A residue plays a critical role in the enzymatic reaction. Schematic drawing for the formation of the spliceosome during RNA splicing. U1, U2, U4, U5 and U6 denote snRNAs and their associated proteins.  The U3 snRNA is not involved in the RNA splicing, but is involved in the processing of pre-rRNA.

RNA Processing

Transkripsi

Kodon: rangkaian tiga basa berdampingan yg berdasarkan kode genetik mampu mengendalikan satu asam amino Ikatan asam amino dengan tRNA pada ujung 3’ dpt tjd krn kerja Ligase-aminoasil-tRNA. Antikodon tRNA mrpk pasangan antiparalel kodon mRNA.

Genetic code

Ribosom Ribosom adalah organel di dalam sel tempat terjadinya sintesis protein. Ribosom terdiri dari, 2/3 berupa rRNA dan 1/3 berupa protein. Perangkaian AA berlangsung pd permukaan ribosom Ribosom bergerak sepanjang mRNA membaca kodon-serta mencocokkan antikodon pd t-RNA. Pemasangan kodon dgn antikodon penterjemahan kodon mRNA menjadi rangkaian asam amino rantai polipeptida. Struktur ribosom menyediakan tempat utk proses penterjemahan. Terdiri dua sub unit: kecil (1/3 masa ribosom), dan besar rRNA memungkinkan ribosom untuk dapat mengenali tRNA dan mRNA r

Subunits of a ribosome. Ribosomes consist of a small (30S) and larger (50S) subunits. The 30S unit has 16S rRNA and 21 different proteins. The 50S subunit consists of 5S and 23S rRNA and 34 different proteins.

Situs di dlm ribosom Satu situs untuk mRNA (pada sub unit kecil) dua situs untuk tRNA (situs A dan P, sebagian besar pada sub unit besar) Satu situs untuk enzim peptidil transferase (pada sub-unit besar). Ukuran ribososom cukup besar untuk dapat mengikat dua molekul tRNA dan sekitar 40basa mRNA.

Translasi Translasi: proses penterjemahan rangkaian kodon mRNA menjadi rangkaian asam amino polipeptida. Pembacaan kodon oleh ribosom dimulai dari kodon awal/ start codon (AUG pertama dr ujung 5”) sampai salah satu kodon akhir (UAA, UAG atau UGA). Tahapan: Inisiasi/ initiation (pengenalan situs awal Perpanjangan (elongation), dan penutupan sintesis polipeptida

1. Inisiasi Pada E.coli, inisiasi dibantu 3 protein (Initiation factor): IF1, IF2, dan IF3. IF3 bertugas memisahkan sub-unit kecil ribosom dr sub-unit besar setelah selesai translasi sebelumnya. IF1 dan IF2: mendorong penempelan aminoasil-tRNA inisiator dan mRNA kepada sub-unit 30S sehingga aminoasil-tRNA inisiasi dan kodon awal mRNA tepat berada pd situs P sub-unit ribosom kecil, sedangkan kodon dan antikodonnya berpasangan. Kodon inisiator (AUG) menyandikan asam amino N-formylmethionine (f-Met). Hasil inisiasi: satu ribosom sempurna yg berasosiasi dengan aminoasil-tRNA inisiator dan mRNA.

Two models of tRNA.

2. Perpanjangan (elongation), Diperlukan: EF (elongation factor), enzim peptidil transferase, GTP. Pd ribosom sempurna, tersedia dua situs aminoasil-tRNA (situs P dan A), dimana situs P ditempati aminoasil-tRNA inisiator. Perpanjangan polipeptida dimulai dengan masuknya aminoasil-tRNA yg kedua menempati situs A. Apabila antikodon pd aminoasil-tRNA cocok dg kodon pd situs A maka peptidil transferase akan menggabungkan dua asam amino yg dibawa oleh kedua aminoasil-tRNA yg berdampingan pada ribosom tsb. Peptidil transferase akan melepaskan asam amino dr tRNA yg menempati situs P, dan menggabungkannya pada AA yg ada pd situs A menghasilkan peptidil-tRNA pd situs A

tRNA yg tlh terdeasilasi dikeluarkan dr situs P, dan peptidil-tRNA yg tdpt pd situs A akan pindah ke situs P, yg terjadi bersamaan dengan pergerakan ribosom kearah ujung 3’, membaca kodon berikutnya. Siklus akan berulang, aminoasil-tRNA baru akan masuk situs A, diikuti transferase peptidil, melakukan reaksi AA membentuk peptidil baru, translokasi peptidil-tRNA dari situs A ke P, berulang terus sampai ditemukan kodon akhir/ stop kodon (UAA, UAG atau UGA).

3. Termination (terminasi/ pemberhentian) Terminasi (pemberhentian) sintesis polipeptida akan terjadi ketika ribosom mencapai kodon tanda berhenti ( "Stop" Codon) yaitu salah satu diantara 3 kodon ini (UAA, UAG, UGA), Stop codon adalah triplet yang tidak dikenali oleh tRNA, tetapi dikenali oleh 2 protein releasing factors (R), yaitu R1 yang mengenali UAG dan UAA, serta R2 yang mengenali UAA and UGA). Begitu ketemu stop kodon, tidak ada aminoasil-tRNA yg dpt menempel pd situs A, krn tdk ada antikodon yg cocok  proses perpanjangan berakhir. Dengan terminasi ini maka akan dilepaskan polipeptida yang dibentuk, tRNA dan disosiasi ribosom menjadi sub-unit kecil (30S) dan sub-unit besar (50S) Polipeptida yang dilepaskan akan diproses pada bagian-bagian sel yang berbeda-beda, tergantung pada peran dan tempatnya.

Keseluruhan Sintesis protein