Pullulanase Type 1 Pullulan 6-glucanohydrolase EC 3. 2. 1 Pullulanase Type 1 Pullulan 6-glucanohydrolase EC 3. 2. 1. 41 (Baccillus subtilis strain 168) Oleh: Riong Seulina Panjaitan (20511313) Nelson Gaspersz (20512021)

Agenda Presentasi Klasifikasi Enzim Mekanisme Reaksi Enzim Isolasi, Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Struktur 3D Enzim Pullulanase Inhibitor Enzim Kegunaan dan Aplikasi Enzim

Klasifikasi Enzim EC. 3. 2. 1. 41 Pullulanase Pada senyawa pullulan, pati dan amilopektin Menghidrolisis ikatan glikosida Kelas Hidrolase Recommended Name: pullulan 6-glucanohydrolase Synonim Name: α-dextrin endo-1,6-α-glucosidase amylopectin 6-glucanohydrolase limit dextrinase

Hidrolisis Pullulan Pullulanase Jelaskan proses hidrolisis dan hubungkan dengan prinsip uji aktivitas selulase dari glukosa yang terbentuk sebagai produka akhir

Peremajaan Bakteri kultur inokulasikan dalam media LB 500 mL Inkubasi, t= 24 jam, T =37 oC, diinduksi dengan IPTG pada 600 nm kultur inokulasikan dalam media LB 500 mL

Inokulasi Bakteri Penghasil Enzim Pullulanase Kultur Bakteri Media LB 500 mL+ Ampisilin 100 µg/mL Koloni Bakteri Inkubasi t= 60 jam, T= 18°C

Isolasi Enzim Kultur bakteri Supernatan : dimurnikan dan uji aktivitas enzim ekstraseluler Sentrifugasi pada 6000 rpm, t=20 menit, T=4oC Sentrifugasi 14000 rpm, t=30 menit, T=4oC pellet Sonikasi Buffer tris-HCl pH 8,1 Supernatan : dimurnikan dan uji aktivitas enzim intraseluler

Pemurnian Enzim Crude Extract Enzim Pullulanase Dialisis dengan buffer Supernatan : fraksinasi Amonium Sulfat 60 % dan sentrifugasi Supernatan Sentrifugasi Pellet dilarutkan buffer tris-HCl pellet Enzim Pullulanase Dialisis dengan buffer Protein dialirkan ke dalam kolom dan dielusi dengan garam

Uji Aktivitas Enzim (Bernfeld 1955) 500 µL pullulan 1 % + 450 µLbuffer asetat 0,2 M pH 5,4 dibiarkan selama 15 menit + 50 µL enzim inkubasi T= 37°C t= 4 menit + 1 mL pereaksi DNS campuran divorteks, didihkan, t=5 menit absorban diukur = 540 nm ∑ Gula pereduksi diukur dengan kurva standar glukosa

Pengujian Enzim Penentuan pH optimum dan suhu optimum Penentuan parameter kinetika Penentuan pH optimum dan suhu optimum Kadar protein diukur  = 280 nm

Karakterisasi Enzim Analisis Berat Molekul SDS-PAGE Kristalisasi dan Penentuan Struktur 3D dengan XRD

Tabel Hasil Pemurnian Enzim

SDS-PAGE Enzim

Struktur Enzim Pullulanase Struktur Kristal Enzim Pullulanase Struktur 3D Enzim Pullulanase

Inhibisi Enzim Mekanisme Inhibisi Enzim dapat dibagi 2 yaitu: Inhibisi reversibel Membentuk kompleks enzim inhibitor yang meningkatkan laju reaksi Inhibisi irreversibel Membentuk senyawa yang stabil dengan enzim melalui ikatan kovalen dengan residu asam amino pada sisi aktif Enzim ini dapat menginhibisi produk dan sustrat : Untuk inhibisi substrat  banyak substrat yang dapat digunakan oleh organisme ketika konsentrasi enzim rendah dan ketika konsentrasi enzim tinggi substrat dapat bertindak sebagai inhibitor pertumbuhan yang beracun Untuk inhibisi produk  Inhibisi produk akan meningkat ketika produk mengikat enzim bebas dan memblok akses ke substrat. Sehingga enzim ini bersifat sebagai inhibitor kompetitif

Kegunaan dan Aplikasi Enzim Industri Aplikasi Pengolahan Pati Sirup Fruktosa Sirup Maltosa, Maltotriosa Pemanis makanan Pembuatan Bir Pada pembuatan malt bir Produksi Alkohol Produksi Etanol, butanol, aseton Pembuatan Roti Mengubah pati menjadi gula fermentasi Tekstil Pada proses pembuatan kain katun untuk memperkuat benang dan men cegah kerusakan pada proses penenunan Detergen Sebagai aditif pada detergen pencuci piring dan pakaian

REFERENSI Malle, D., T. Itoh, W. Hashimoto, K. Murata, S. Utsumi and B. Mikami, 2006, Overexpression, purification and preliminary X-ray analysis of pullulanase from Bacillus subtilis strain 168, Acta Cryst. (2006). F62, 381-384. Singh, Ram S., G. K. Saini, J. F. Kennedy, 2010, Maltotriose syrup preparation from pullulan using pullulanase, Carbohydrate Polymers 80 (2010) 401–407. Zhang, H., Y. Tian, Y. Bai, X. Xu, Z. Jin, 2012. Structure and properties of maize starch processed with a combination of α-amylase and pullulanase. Int. J. Biol. Macromol. 3407 (2012) 1-7.

Prof. Dr. Fida M. Warganegara Terimakasih Prof. Dr. Fida M. Warganegara