Spektrofotometri UV – Visibel (Bagian II) JURUSAN FARMASI FKIK UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN Spektrofotometri UV – Visibel (Bagian II) Oleh : Hendri Wasito, S. Farm., Apt.

Sinar (Radiasi Elektro Magnetik)

Ketika Sinar menabrak benda ??? Cahaya (sinar) dengan tenaga radian P0 menabrak permukaan pertama sampel dengan ketebalan = b cm Cahaya (sinar) dengan tenaga radian P0 menabrak permukaan pertama sampel dengan ketebalan = b cm Tenaga radian P ditransmisikan (diteruskan) Tenaga radian R2 dipantulkan Harris, 1987

TRANSMISI QUARTZ Jadi Quartz mentransmisikan 93 % dan Sinar datang dari medium 1 (udara indeks bias 1,00) tegak lurus mengenai medium 2 yaitu permukaan Quartz (indeks bias 1,46). Berapa fraksi sinar yang diteruskan ? Jadi Quartz mentransmisikan 93 % dan memantulkan 7 % tenaga sina datang

Ketika Sinar Menabrak Sampel ??? Ditransmisikan Diserap Dipantulkan Dihamburkan Apabila sampel tidak menyerap cahaya, proses yang terjadi hanyalah : - pemantulan - transmisi (diteruskan)

Instrumentasi Spektrofotometer UV-Vis

Instrumentasi Spektrofotometer UV-Vis Sumber lampu lampu deuterium untuk UV (190 -350 nm), lampu halogen kuarsa / tungsten untuk Visibel (350 – 900nm). Monokromator Untuk mendispersikan sinar ke komponen panjang gelombang yang selanjutnya dipilih oleh celah (slit). Optik Untuk memecah sumber sinar pada spektrofotometer berkas ganda (doubel beam) Detektor Penangkap sinar yang ditransmisikan untuk selanjutnya diolah oleh amplifier .

Penyerapan sinar UV & Visibel oleh Molekul Penyerapan (absorbsi) sinar UV dan Visibel pada umumnya dihasilkan oleh eksitasi elektron-elektron ikatan. Jenis penyerapan energi UV dan Visibel : Penyerapan oleh transisi elektron ikatan dan elektron anti ikatan Penyerapan oleh transsi elektron d dan f dari molekul kompleks Penyerapan oleh perpindahan muatan

Penyerapan oleh transisi ikatan dan elektron anti ikatan Semua molekul organik mampu menyerap REM karena memiliki elektron valensi yang dapat dieksitasikan ke tingkat energi ya ng lebih tinggi. Penyerapan radiasi UV dan Visibel dibatasi oleh sejumlah gugus fungsional tertentu (kromofor) yang mengandung elektron valensi dengan tingkat energi eksitasi yang rendah. Elektron yang terlibat : elektron sigma, elektron phi, dan elektron bukan ikatan.

electronic molecular orbital energies

Diagram tingkat energi elektronik TRANSISI ELEKTRONIK ------------------- σ* ------------------- π * ------------------- n ------------------- π ------------------- σ Transisi sigma – sigma star (σ – σ*) Transisi n – sigma star (n - σ*) Transisi n – phi star (n – π*) Transisi phi – phi star (π - π*) Diagram tingkat energi elektronik

Transisi sigma - sigma star (σ – σ*) Energi yang diperlukan sesuai energi sinar pada frekuensi yang terletak pada UV vakum (< 180 nm) Kurang begitu bermanfaat untuk analisis dengan spektrofotometri UV-Vis Contoh : Metana dengan ikatan (–C-H)  λ (125 nm) Etana, dengan ikatan (C-C)  λ (135 nm)

Transisi non bonding – sigma star ( n – σ* ) Terjadi pada senyawa organik jenuh yang mengandung atom-atom dengan elektron bukan ikatan (e- n) seperti pada sekitar atom N, O, S, dan halogen. Sinar yang diserap sekitar λ 150 – 250 nm Nilai absorbtivitas molar (ε) 100 – 3000 liter/cm.mol Pengaruh pelarut lebih polar akan menggeser λ ke lebih pendek (pergeseran biru / Hypsocromic shift)

Transisi n – phi star dan phi – phi star (n – π*) dan (π - π*) Molekul tersebut harus memiliki gugus fungsional yang tidak jenuh sehingga ikatan rangkap dalam gugus tersebut dapat memberikan orbital phi yang diperlukan. Transisi ini paling cocok untuk analisis (λ 200 – 700 nm) dan dapat diaplikasikan pada spektrofotometer UV-Vis. Pelarut dapat mempengaruhi transisi karena berkaitan dengan perbedaan mensolvasi pelarut pada keadaan dasar dengan keadaan tereksitasi.

Transsisi (n – π*) dan (π - π*)

Perbedaan transisi (n – π*) dan (π - π*) Nilai ε (10 – 100 liter/cm.mol) Nilai ε (1000 – 10.oo0 liter/cm.mol) Biasanya, pelarut polar menyebabkan pergeseran biru (hypsochromic schif) Biasanya, pelarut polar menyebabkan pergeseran merah (bathocromic shif) Pengaruh pelarut pada pergeseran n  π* pelarut air metanol etanol kloroform heksana Λ (nm) 264,5 270 272 277 279

Transisi π - π* (bathrocromic shift) Transisi n – π* E Non polar polar Transisi n – π* (hipsocromic shift) E Non polar polar

PHENOBARBITAL SPECTRUM Pengaruh pH terhadap λ pH 9,2 PHENOBARBITAL SPECTRUM

Kromofor Organik dan Auksokrom Kromofor merupakan semua gugus atau atom dalam senyawa organik yang mampu menyerap sinar UV dan Visibel. Contoh kromofor : C6H13CH=CH2, CH3N=NCH3, CH3NO2, C2H5ONO2, dsb. Auksokrom merupakan gugus fungsional yang memiliki elektron bebas (-OH, -O, -NH2, dan –OCH3) yang emberikan transisi n  π*. Terikatnya auksokrm pada gugus kromofor mengakibatkan batokromic shift disertai efek hiperkromic.

Pengaruh konjugasi terhadap puncak serapan Ikatan terkonjugasi berupa ikatan rangkap yang berselang-seling dengan satu ikatan tunggal. Elektron-elektron phi mengalami delokalisasi lanjut sehingga tingkat energi π* menurun dan mengurangi karakter anti ikatan batocromic shift. RIBOFLAFIN

Penyerapan yang elibatkan elektron d dan f Kebanyakan ion-ion logam transisi menyerap di daerah UV dan Visibel. Absorbsi ion lantanida dan aktinida dihasilkan oleh transisi elektronik elektron 4f dan 5f dengan pita serapan anorganik lebih sempit dan karakteristik tertentu. Absorbsi logam gol. transisi pertama dan kedua dihasilkan oleh transisi elektron 3d dan 4d dengan pita serapan yang seringkali melebar dan dipengaruhi faktor lingkungan.

Penyerapan karena perpindahan muatan Absorbsifitas molar sangat besar (ε > 10.000 liter/cm.mol). Contoh : senyawa kompleks beberapa ion anorganik sepert kompleks Fe(III)SCN, Fe(III)-fenolik, Fe(II)-fenantrolin. Kompleks harus memiliki sifat donor elektron dan komponen lainnya sebagai akseptor elektron. Kecendrungan perpindaan elektron meningkat  energi radiasi yang dibutuhkan kecil  λ panjang

Aspek kualitatif dan kuantitatif Spektrofotometri UV-Visibel Data yang diperoleh dari spektra UV-Vis : λmax, intensitas, efek pH dan pelarut. Dalam aspek uantitatif, diukur intensitas sinar radiasi yang diteruskan setelah mengenai sampel/cuplikan. P / Po % T A 1 100 0,1 10 0,01 2

Pembatasan dalam Hukum Lambert-Beer Sinar yang digunakan dianggap monokromatis Peyerapan terjadi daam volume yang memiliki penampang luas yang sama Tidak ada senyawa lain yang menyerap dalam larutan senyawa Tidak terjadi fluoresensi atau fosforesensi Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan

Hukum Lambert-Beer A = =  b c Jika sinar monokromatic dilewatkan suatu larutan maka penurunan insensitas sinar berbanding langsung dengan insensitas radiasi ( I ), konsentrasi spesies (c), dan dengan ketebalan lapisan larutan (b). A = =  b c

Absorbtivitas molar () () merupakan suatu konstanta yang tidak tergantung pada konsentrasi, tebal kuvet dan insensitas radiasi yang mengenai sampel. () tergantung pada suhu, pelarut, struktur molekul, dan λ radiasi. () satuannya M-1cm-1 atau liter/mol. jika konsentrasi dinyatakan dengan % b/v (g/100mL) dapat dinyatakan dengan simbol E 1%1cm () = (BM/10 ) x E 1%1cm

Analisis komponen tunggal Jika absorbansi suatu seri larutan diukur pada λ, suhu, kondisi pelarut sama, dan A larutan diplotkan terhadap konsentrasinya  kurva baku. Penentuan konsentrasi komponen tunggal dapat dilakukan dengan : Menggunakan informasi absorbtivitas molar Menggunakan persamaan regresi linier kurva baku

Contoh soal Sebanyak 20 tablet furosemid ditimbang beratnya 1,656 g. Diambil sampel 519,5 mg digojog dengan 300 mL NaOH 0,1 N , lalu diencerkan sampai 500,0 mL dengan NaOH 0,1 N. Sejumlah ekstrak disaring dan diambil 5,0 mL lalu diencerkan dengan NaOH 0,1 N sampai 250,0 mL. Absorbansi dibaca pada λ 271 nm dengan blanko NaOH 0,1 N ternyata absorbansinya 0,596. Jika E 1%1cm furosemid λ271 nm = 580, Hitung kadar Furosemid tiap tabletnya ?

Analisis dua campuran secara bersama-sama Dua buah kromofor yang berbeda akan memiliki kekuatan absorbsi cahaya yang berbeda pada suatu λ tertentu, sehingga dengan mengukur kedua λ akan diperoleh konsentrasi masing-masing komponen campuran. A1 = a1 b1 c1 dan A2 = a2 b2 c2, karena tebal kuvet sama maka A1 = a1 c1 dan A2 = a2 c2 sehingga : Aλ1 = (a1c1) λ1 + (a2c2) λ1 Aλ2 = (a1c1) λ2 + (a2c2) λ2

Contoh soal Absorbansi obat A dengan konsentrasi 0,0001 M dalam kuvet 1 cm adalah 0,982 pada λ 420 nm, dan sebesar 0,216 pada λ 505 nm. Absorbansi obat B dengan konsentrasi 0,0002 M adalah 0,362 pada λ 420 nm dan 1,262 pada λ 505. Absorbansi campuran 2 obat adalah 0,820 pada λ 420 nm, dan 0,908 pada λ 505 nm. Berapakah konsentrasi masing-masing obat A dan B dalam campuran tersebut ?

Hal-hal penting dalam pengukuran spektrofotometri UV-Visibel Terutama untuk senyawa yang semula tidak berwarna dan akan diukur dengan spektrofotometer Visibel  dilakukan derivatisasi. Waktu operasional (operating time) untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Pemilihan panjang gelombang maksimum (λ max) Pembuatan kurva baku sebaiknya sering diperiksa ulang. Pembacaan absorbansi sampel/cuplikan sebaiknya dalam rentang 0,2 – 0,8.

Derivatisasi sampel Syarat pereaksi : Reaksinya selektif dan sensitif Reaksinya cepat, kuantitatif, dan reprodusiel Hasil reaksi stabil dalam jangka waktu yang lama

Gambar operating time Operating Time Ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi larutan. Pengukuran senyawa harus dilakukan pada saat waktu operasionalnya. Gambar operating time

Pemilihan panjang gelombang (λ) Panjang elombang yang digunakan adalah λmax. Alasan : Kepekaan maksimal Hukum Lambert-Beer terpenuhi Kesalahan akan kecil

Pembuatan kurva baku

Pembacaan absorbansi sampel (0,2 – 0,8) Absorban yang terbaca hendaknya A = 0,2-0,8 atau %T = 15 % - 70 % agar kesalahan fotometrik dalam pembacaan transmitan sebesar 0,005 atau 0,5 %

Kalibrasi instrumen Kalibrasi skala absorbansi  digunakan senyawa kalium dikromat. Kalibrasi skala λ  dengan larutan holmium perklorat 5 % b/v. Penentuan daya pisah (resolusi) spektrofotometer  dikontrol dengan lebar celah dengan larutan toluen 0,02 % b/v dalam heksan. Penentuan adanya sesatan sinar (stray radiation)  dengan larutan KCl 1,2 % b/v dalam air pada λ 200 nm, jika A = 2 maka terjadisesatan sinar.

Latihan Soal Tolbutamid (BM 270,4) memiliki absorbtivitas molar 703/M.cm, pada λ 262 nm. Jika tablet tunggal tolbutamid dilarutkan dalam air sampai 250,0 mL, absorbansinya 0,520 pada λ 262 nm, dan kuvet 1 cm. Tentukan berat tolbutamid yang terkandung dalam tablet ersebut ! Absorbansi senyawa murni X dan senyawa Y dengan konsentrasi masing-masing 5 x 10-5 M sebagai berikut ( X A280 = 0,0510 A350 = 0,192 dan Y A280 = 0,335 A350 = 0,150). Salah satu larutan dari keduanya dengan konsentrasi yang belum diketahui mempunyai A280 = 0,395 dan A350 = 0,147. Senyawa manakah (X atau Y) yang tidak diketahui ? Hitung konsentrasi senyawa yang tidak diketahui tersebut !

HATUR NUHUN PISAN ...... Jangan lupa untuk membaca literatur lainnya baik dari buku maupun internet serta banyak latihan soal ... Kita BISA karena BIASA ...