Ekspresi gen 2. Translasi Drs. Sutarno, MSc., PhD

Kode Genetik

The Genetic Code uses three bases to specify each amino acid

Perangkat yg diperlukan dalam translasi mRNA tRNA Ribosome enzymes

mRNA: sebagai pola cetakan untuk rangkaian asam amino, pola ini dlm bentuk rangkaian kodon. Kodon: rangkaian tiga basa berdampingan yang berdasarkan kode genetik mampu mengendalikan satu asam amino Ikatan asam amino dengan tRNA pada ujung 3’ dpt tjd krn kerja Ligase-aminoasil-tRNA. Antikodon tRNA mrpk pasangan antiparalel kodon mRNA.

Ribosom Perangkaian AA berlangsung pd permukaan ribosom Ribosom bergerak sepanjang mRNA membaca kodon-serta mencocokkan antikodon pd t-RNA. Pemasangan kodon dgn antikodon adalah merupakan penterjemahan kodon mRNA menjadi rangkaian asam amino rantai polipeptida. Struktur ribosom menyediakan tempat utk proses penterjemahan. Terdiri dua sub unit: kecil (1/3 masa ribosom), dan besar rRNA memungkinkan ribosom untuk dapat mengenali tRNA dan mRNA

Komponen penyusun ribosom E. Coli Tikus Ribosom total 70S 80S 2520000 dalton 4420000 dalton Ribosom kecil 30S 40S 930000 dalton 1400000 dalton rRNA Protein 16S=1541 basa 40% 18S=1900 basa 50% Ribosom besar 50S 60S 1590000 dalton 2820000 dalton rRNA Utama 23S=2904 basa 28S=4700 basa rRNA kecil 5S=120 basa 5.8S=160 basa 70% 30% 65% 35%

Situs di dlm ribosom Satu situs untuk mRNA (pada sub unit kecil) dua situs untuk tRNA (situs A dan P, sebagian besar pada sub unit besar) Satu situs untuk enzim peptidil transferase (pada sub-unit besar). Ukuran ribososom cukup besar untuk dapat mengikat dua molekul tRNA dan sekitar 40basa mRNA.

Tahapan sintesis polipeptida Translasi: proses penterjemahan rangkaian kodon mRNA menjadi rangkaian asam amino polipeptida. Pembacaan kodon oleh ribosom dimulai dari kodon awal/ start codon (AUG pertama dr ujung 5”) sampai salah satu kodon akhir (UAA, UAG atau UGA). Tahapan: Inisiasi/ initiation (pengenalan situs awal Perpanjangan (elongation), dan penutupan sintesis polipeptida

Inisiasi Penempelan sub-unit kecil ribosom pada mRNA terjadi pada ruas “Shine-Dalgaro”, suatu rangkaian nukleotida yg tdpt di sebelah hulu ruas penyandi dan basa-basanya dapat berpasangan dengan rangkaian basa ujung 3’rRNA 16S. Kecocokan perpasangan basa antara kedua ruas menentukan keberhasilan isisiasi translasi Pada E.coli, inisiasi dibantu 3 protein (Initiation factor): IF1, IF2, dan IF3. IF3 bertugas memisahkan sub-unit kecil ribosom dr sub-unit besar setelah selesai translasi sebelumnya. IF1 dan IF2: mendorong penempelan aminoasil-tRNA inisiator dan mRNA kepada sub-unit 30S  aminoasil-tRNA inisiasi dan kodon awal mRNA tepat berada pd situs P sub-unit ribosom kecil, kodon dan antikodonnya berpasangan. Hasil inisiasi: satu ribosom sempurna yg berasosiasi dengan aminoasil-tRNA inisiator dan mRNA. Untuk proses ini diperlukan energi yg diperoleh dg menghidrolisis GTP menjadi GDP dan P.

Initiation first step: the small 30S subunit of the ribosome binds to the mRNA molecule: this contains triplet codon (AUG, or GUG) at which protein synthesis starts. In bacteria, the first AA-tRNA to initiate translation is always a formyl derivative of methionine called FMet-tRNA. The ribosome is able to discriminate between an AUG within an RNA sequence and at the beginning of mRNA. When this codon appears in the middle of messenger RNA, a normal methionine is incorporated. In eukaryotes, synthesis is started by a special initiation Met-tRNA, but the methionine is not formylated. However, the initial methionine is usually split off from the finished polypeptide. The start of translation requires three protein factors, and the binding of an initiator Fmet-tRNA (or Met) to the first AUG codon found on mRNA.

Asam amino R ! H2N-C-COOH H R1 R2 R3 H2NCHCO-HNCHCO-HNCO Asama amino: molekul organik yg mengandung gugus amin (-NH2) dan karboksil (-COOH). Mrpk molekul dasar dari protein, yg dirangkai mjd rangkaian asam aminomatau rantai polipeptida R ! H2N-C-COOH H R1 R2 R3 H2NCHCO-HNCHCO-HNCO

Perpanjangan (elongation), Diperlukan: EF (elongation factor), enzim peptidil transferase, GTP. Pd ribosom sempurna, tersedia dua situs aminoasil-tRNA (situs P dan A), dengan situs P ditempati aminoasil-tRNA inisiator. Perpanjangan polipeptida dimulai dengan masuknya aminoasil-tRNA yg kedua menempati situs A. Apabila antikodon pd aminoasil-tRNA cocok dg kodon pd situs A maka peptidil transferase akan menggabungkan dua asam amino yg dibawa oleh kedua aminoasil-tRNA yg berdampingan pada ribosom tsb. Peptidil transferase akan melepaskan asam amino dr tRNA yg menempati situs P, dan menggabungkannya pada AA yg ada pd situs A menghasilkan peptidil-tRNA pd situs A

tRNA yg tlh terdeasilasi dikeluarkan dr situs P, dan peptidil-tRNA yg tdpt pd situs A akan pindah ke situs P, yg terjadi bersamaan dengan pergerakan ribosom kearah ujung 3’, membaca kodon berikutnya. Siklus akan berulang, aminoasil-tRNA baru akan masuk situs A, diikuti transferase peptidil, melakukan reaksi AA membentuk peptidil baru, translokasi peptidil-tRNA dari situs A ke P, berulang terus sampai ditemukan kodon akhir (UAA, UAG atau UGA).

Step 1 of Elongation Binding of the bigger subunit of the ribosome to the small one, to form the complete 70S ribosome (Diagram 2).

Then the second AA-tRNA arrives in the Aminoacyl site (acceptor site), and binds to the complex (Diagram 3).

The reaction between the first amino acid and the second one leads to the formation of a peptide bond. A molecule of water is released ( it is a condensation reaction) (Diagram 3b). This only happens after hydrolysis of a GTP into GDP which allows the elongation factor to leave. This delay allows for proof reading as a wrong tRNA would leave before the reaction takes place.

Step 2 of Elongation The second tRNA has now moved into place and the now free tRNA has been released. Translocation can take place: it is the transfer of the newly formed dipeptide into the peptidyl site (the first one, also called donor site) (Diagram 4) when the ribosome shifts 3 nucleotides.

The third AA (R)-tRNA can then bind to the mRNA / ribosome complex, and a new peptide bond is formed (Diagram 5).

This step is a repeat of step two, to show that once the process starts, it is fast, and repetitive. Diagram 6 a and b

Termination Terminasi terjadi ketika ribosom bertemu salah satu kodon stop /"Stop" Codon (UAA, UAG, atau UGA), Chain termination leads to the release of a polypeptide, and tRNA, and the dissociation of the ribosome into 30S and 50S subunits. Stop codons are triplets which are not recognized by any tRNA (UAA, UAG, UGA), but by two proteins: the releasing factors (R), (R1 recognizes UAG and UAA, R2 recognizes UAA and UGA). Begitu ketemu stop kodon, tidak ada aminoasil-tRNA yg dpt menempel pd situs A, krn tdk ada antikodon yg cocok  proses perpanjangan berakhir. The polypeptide released will be processed in different parts of the cell, depending on its role, and destination. All the processing involved depends on the polypeptide sequence, therefore on the mRNA sequence (and therefore on the original DNA base sequence).

Transformasi Pengambilan DNA secara langsung oleh sel  perpindahan sifat genetik. Perpindahan dapat terjadi jika sel penerima adalah kompeten (sel yg mampu menyerap molekul DNA) Menjadikan kompeten: Kejutan panas Pendinginan dlm larutan CaCl2 Freeze-thaw

Transduksi Transduksi: Transfer bahan genetik melalui infeksi virus Transfeksi: pemasukan DNA pada sel mamalia Konjugasi: suatu proses biologis dimana DNA dipindahkan dari satu sel ke sel lain melalui kontak antar sel.