Sulistiyo Mardiatmoko, ST Pusat Studi Pangan dan Gizi UGM, PELATIHAN HPLC OLEH : Sulistiyo Mardiatmoko, ST Pusat Studi Pangan dan Gizi UGM, Yogyakarta

PELATIHAN HPLC UPN “Veteran” Jawa Timur Peserta : 1. Dr. Ir. Ni Ketut Sari, MT (TK/FTI) 2. Ir. Nana Dyah, MP(TK/FTI) 3. Ir. Sri Winarti, MP(TP/FTI) UPN “Veteran” Jawa Timur

HPLC (High Pressure Liquid Chomatography) Kromatografi Cair Tekanan Tinggi 1. Mobile Phase (Pelarut / Eluen) 2. Preparasi Sampel 3. Seperangkat Alat HPLC Dilengkapi Komputer 4. Analisa Hasil

1. Mobile phase (Pelarut) JENIS KOLOM : Jenis C-18 atau ODS (Ortho Dexyl Sylil), ODS Hypersyl Mobile phase : Acetonitril Jenis C-8 atau RP-8 Lichrosorp (nama patent), Mobile phase : ELUEN, 58% Na Acetat 0,01 M; 22% Asam Acetat 1% ; 20 % Methanol 1 % Pustaka : Pengenalan HPLC (J. Hamilton P. 202)

2. Preparasi Sampel Diperoleh dari Jurnal, Pustaka Contoh : Analisa kafein pd kopi bubuk 0,5 gr kopi--dilarutkan dg 1 ml aquabides, Diencerkan, disaring dg kertas saring no. 42 (porositas ≤ 0,45 mikron). Penyaring sebaiknya dari nylon, bkn selulosa. Udara hrs dihilangkan dari larutan sampel.

Cara Membuat Eluen : Jenis Kolom C-8 : 58% Na Acetat 0,01 M (A) ; 22% Asam Acetat 1% (B) ; 20 % Methanol 1%(C) A B C 174 ml 66 ml 60 ml 300 ml (3x58) (3x22) (3x20)

Na Acetat : Asam acetat : Methanol : Na acetat 0,01 M sebesar 174 ml, digunakan labu takar 250 ml Berat Na acetat tiap 1 liter = 82 (MR Na acetat) x 0,01 = 0,82 gr Berat Na acetat tiap 250 ml = 0,82 / 4 = 0,205 gr, Timbang Na acetat sebanyak 0,205 gr dilarutkan dalam Aquabides sebanyak 250 ml Asam acetat : 99,8 % b dilihat pada label zat yang dipakai, 1% = 1N V1 N1 = V2 N2 ; V1 = (100 x 1) / 99,8 = 1,002 ml 1,002 ml As. Acetat dalam 100 ml aquabides, menggunakan labu takar 100 ml Methanol : Idem dengan cara kerja Asam acetat

3. Seperangkat alat HPLC Dilengkapi Komputer Blok Diagram HPLC D A C B F E Detektor CSM (Chomatography System Manager) atau Interface CSM Pompa Kolom Komputer Botol Penampung Mobile Phase (Pelarut) E

Prosedur HPLC Membersihkan (flashing) : Jika kolom sering digunakan, Absorban (A) tidak stabil,dibersihkan menggunakan acetonitril Terjadi trouble, misalnya komputer belum di set, tetapi injektor sudah ditutup, kita tunggu 15 menit, nanti dikeluarkan lewat penampung (dibelakang kolom) . Membersihkan kolom, dengan cara : selang kapiler dipindahkan ke botol yang berisi acetonitril, set flow rate = 0,5 ; pompa dihidupkan (warna biru) dengan cara menekan. Membersihkan kolom yang mengandung buffer (fospat, acetat), dibersihkan terlebih dahulu dengan aquabides, kemudian pakai metanol (15 menit), cara idem no. 3.

Prosedur HPLC Dihidupkan terlebih dahulu ± 30 menit lebih awal dari B Step-1 : Dihidupkan terlebih dahulu ± 30 menit lebih awal dari B A C B 1 1= on 0 = off

Step-2 : Setting Data di Komputer : Nyalakan komputer, password tkfti, klik 2 x HPLC, password tkfti, tampak tampilan PowerStream, CECIL Klik New, tampil New PowerStream module, klik New Method module, ketik pada Comment (Coba-1), close (X), yes, ok Klik New, tampil Injection Wizard-Samples, next Tampil Injection Wizard – Method Selection,  Find All, timbul (Name, Folder, Modified, Created), next Tampil Injection Wizard-Injection Properties, Type of sample(s) {Unknow (belum diketahui), Standart (larutan standar)}, Samples Properties (isi sesuai prosedur), Chromatogram Properties : Name Prefix (Cgm), Folder (membuat folder baru, mis : Mahasiswa TP), next Tampil Injection Wizard-Calculation Factors, Conc. Factor (1.000), ISTD Conc (1.000), finish

Tampil PowerStream, Klik ∆ (Acquire Data) : Channel No. (1) Comments (Acquired via channel 1) Detector : {Detector Units (A), Detector Range (1.000), Detector offset (0.000)}, centang () Wavelengh (nm) [isi sesuai prosedur, mis 272 nm untuk coffein] Injections : centang () Inj. Volume (L) [30], centang () Loop Volume (L) [20], centang () Sample Conc. (g/L) [….], centang () Sample Dilution[….] Column : (data diisi sesuai dengan kolom yang digunakan) Pumps : centang () Total Flow (mL/min) [sesuai prosedur (0,5)] Klik Acquire, cursor dibawa ke folder yang dibuat, lihat status : WAITING

Step-3 : A. Detektor H A c. Pompa c H. Tempat Injeksi Sample Tekan w-length Setting panjang gelombang (),   = 272 (untuk cafein dari jurnal) Tekan E Absorbance (A) dalam keadaan stabil Tekan zero (warna biru) c. Pompa Tekan flow, dimasukkan flow yang diinginkan, biasanya = 0,5 atau lihat dalam buku. Tekan Run (warna biru) H. Tempat Injeksi Sample Dilakukan setelah detektor dan pompa siap Dalam keadaan load, katup dalam keadaan Injeksi sample, katup ditutup , terus tekan Run

Step-4 : Setting hasil di kompoter :

4. Analisa hasil 1. Menghitung kadar cafein dalam kratingdeng ) Dalam menghitung kadar cafein dalam kratingdeng selalu dalam : gram cafein dalam 100 gram kratingdeng (%b/b) atau gram cafein dalam 100 ml kratingdeng (%b/v) )

1. Menghitung kadar cafein dalam kratingdeng * Area sampel dan area standar didapat dari hasil Running komputer, area cafein = 587,7 dan area kratingdeng = 639,6 * Membuat cafein standar : 100 ppm cafein dalam 10 ml aquabides, 100 ppm/10 ml = (100 mg/l)/10 ml = (100 mg/1000 ml)/10 ml = 1 mg, ditimbang 1 mg cafein standar dilarutkan dalam 100 ml aquabides, kons. cafein standar = 1 mg/100 ml = 10 mg/l = 10 ppm * Sampel (kratingdeng) yang diambil 10 ml kemudian diencerkan dalam 100 ml aquabides, sehingga volume total = 100 ml

2. Regresi linier Regresi linier standar Jika dilakukan injeksi 5 sampel, jika tidak memenuhi kedekatan hasil (r) maka dilakukan injeksi ulang pada sampel daerah yang tidak memenuhi r. r maksimum = 0,999 atau r minimum = 0,8 menunjukkan kwalitas kolom Regresi linier standar Dari regresi linier standar diperoleh persamaan garis linear dan r, Area sampel dimasukkan dalam persamaan linear yang diperoleh dari regresi linier standar, sehingga diperoleh konsentrasi sampel. Konsentrasi Area

lampiran Reparasi : kunci Inggris ukuran 150 mm kunci ukuran 1/4 dan 5/16 Flow arah panah ke bawah D A B C

2. Harga 3. Kelemahan alat HPLC merk cecil Harga untuk analisa Sukrosa dalam gula : Rp 130.000/titik Sistem sewa hplc : Rp 40.000/jam untuk sistem sewa, prosedur dan standar bawa sendiri, preparasi sendiri 3. Kelemahan alat HPLC merk cecil Pompa hanya satu sehingga pemborosan bahan dan menyediakan banyak konsentrasi Cara operasional manual