Spektroskopi Inframerah Dekat Pada Urin Untuk Memperkirakan Ovulasi Pada Panda Raksasa (Ailuropoda melanoleuca) Oleh: Putri Nuristi 0700096

PANDA RAKSASA

Panda raksasa (Ailuropoda melanoleuca) merupakan hewan yang terancam punah karena memiliki tingkat kelahiran yang sangat rendah dilihat dari efisiensi reproduksi yang tidak baik karena panda raksasa betina yang mengalami monoestrus dengan ovulasi spontan selama musim kawin

untuk mempertahankan populasi panda tersebut harus dilakukan penangkaran Agar dapat dimonitor kondisi estrusnya untuk menentukan waktu ovulasi Kondisi estrus dari panda raksasa berasal dari Konsentrasi estrone-3-glucuronide (E1G)

Konsentrasi estrone-3-glucuronide (E1G) biasanya dimonitor dengan : Enzim Immunoassay (EIA) namun analisis ini membutuhkan proses yang panjang dengan reagen yang mahal

Spektroskopi Infra Merah Dekat diperlukan metode analisis yang dapat menemukan waktu optimal untuk panda raksasa berkembang biak lebih cepat dan lebih mudah dari pada EIA Spektroskopi Infra Merah Dekat

Mengapa Spektroskopi Infra Merah Dekat? berguna dalam berbagai bidang untuk analisis komposisi secara cepat, tidak merusak dan akurat.

Radiasi IMD dapat jauh menembus sampel terutama dalam pengujian material “mentah” (belum diolah), tanpa atau hanya sedikit persiapan sebelumnya Mengapa tidak dengan Spektroskopi Infra Merah Tengah?

Struktur estrone-3-glucuronide (E1G)

penelitian ini dilakukan untuk menilai apakah spektroskopi IMD dapat memantau estrogen kemih pada panda raksasa betina

spektroskopi inframerah dekat Secara teori spektroskopi inframerah dekat spektroskopi inframerah dekat merupakan satu teknik spektroskopi yang menggunakan wilayah panjang gelombang inframerah pada spektrum elektromagnetik (sekitar 800 sampai 2500 nm), disana terdapat gugus OH, CH, NH dan C=O. Dikatakan “inframerah dekat” (IMD) karena wilayah ini berada di dekat wilayah gelombang merah yang tampak.

Enzim immunoassay (EIA) Enzim immunoassay (EIA) merupakan metode yang digunakan untuk memperkirakan waktu ovulasi yang optimal dengan memonitor estrogen dalam darah, urin dari betina. EIA biasanya digunakan untuk memonitor estrogen pada panda betina raksasa yaitu dengan metode antibodi ganda.

Pada analisis urin panda raksasa betina, konsentrasi E1G yang dianalisis dengan EIA, berkisar antara 0,22 sampai 127,88 ng mL-1. Nilai menunjukkan peningkatan secara bertahap dari tingkat 0,80 ng mL-1 hingga ke puncak 127,88 ng mL-1 setelah terjadi penurunan tajam.

Instrumentasi

Fourier Transform Near Infrared spectrometer (FT-NIR)

Gambar: (A) Fourier Transform Near Infrared Spectrometer (MPA, Bruker) Gambar: (A) Fourier Transform Near Infrared Spectrometer (MPA, Bruker). (B) skema Scheme or the development of multivariate chemometric models based on FT-NIR spectral data.

FTIR (Fourier Transform Infrared) FTIR (Fourier Transform Infrared). Pada spektroskopi inframerah, radiasi IR dilewatkan pada sampel. Beberapa radiasi inframerah diabsorpsi (diserap) sampel dan sisanya diteruskan (ditransmisikan), spektrum yang dihasilkan mewakili absopsi dan transmisi molekul, membentuk fingerprint dari molekul sampel. Seperti sidik jari (fingerprint), tidak ada dua struktur molekul yang khas yang menghasilkan spectrum inframerah yang sama Gambar 2. Skema perjalanan sinar inframerah dalam komponen FTIR

eksperimen Alat dan Bahan : Alat-alat : Alat sentrifugasi Spektrofotometer MPA (Brucker Inc Billerica, MA) Kuvet Kuarsa Water bath Bahan – bahan : Sampel urin

Pengumpulan sampel urin Urin panda raksasa betina dikumpulkan setiap harinya (selama 25 hari) segera disentrifugasi selama 4 menit disimpan pada suhu -40°C Supernatan

Analisis spektra IMD Supernatan Hasil Spektra dihangatkan sampai 37°C pada water bath dimasukkan kedalam kuvet kuarsa dianalisis dengan menggunakan Spektrofotometer MPA. (Transmitasi spectrum IMD pada sampel urin dari 1100-2432 nm) Hasil Spektra

HASIL DAN DISKUSI

Dalam analisis spektroskopi IMD, penelitian ini dilakukan dalam rentang 1100-1884 nm dan 2012-2432 nm yang diterapkan pada analisis kuantitatif dan kualitatif untuk mengetahui perubahan spektral yang disebabkan oleh berbagai konsentrasi hormon dalam sampel urin. 

model kalibrasi dikembangkan dengan menggunakan Partial Least Square Regression (PLSR) PLSR digunakan untuk mengembangkan model untuk E1G berdasarkan spektra urin IMD. PLSR dalam menentukan variabel laten (faktor PLS). Jumlah optimum faktor PLS ditetapkan menjadi salah satu yang berhubungan dengan Standard Error of Cross Validation (SECV).

Dalam validasi silang, diambil salah satu sampel dari set kalibrasi dan kemudian digunakan untuk validasi. Dengan sisa sampel, model PLS dikembangkan dan diterapkan untuk memprediksi isi masing-masing komponen pada urin.  Hasilnya dibandingkan dengan nilai referensi masing-masing. Prosedur ini diulang beberapa kali sampai prediksi untuk semua sampel diperoleh. Sehingga semua diperoleh nilai rata-rata yang didapat dari SECV sebagai penentuan keakuratan.

Koefisien korelasi, R2, berdasarkan validasi internal adalah 0,94, dan kesalahan Standar validasi silang (SECV) adalah 10,04 ng mL-1 menggunakan 7 faktor optimal PLS (persen kumulatif adalah 99,995%). Tinggi koefisien dalam plot vektor regresi untuk model penentuan total urin E1G ditemukan di 1427, 1500, 1695, 1728, 2200 dan 2295 nm. 

Hasil ini menunjukkan korespondensi baik nilai diperkirakan konsentrasi E1G aktual dengan EIA. Hubungan antara konsentrasi E1G dan nilai prediksi IMD diilustrasikan pada Gambar. 5. Tingginya angka koefisien korelasi spektrum IMD berarti bisa mendeteksi perubahan konsentrasi E1G.

Gambar 5. Hubungan antara prediksi nilai IMD dengan EIA untuk konsentrasi E1G pada panda raksasa betina

Moving Principal component anaysis (MPCA) MPCA menerapkan gagasan bahwa perubahan komponen urin dapat dideteksi dengan pemantauan proses komponen utama (PC). PC dihitung dengan menggunakan spektrum yang dikumpulkan pada hari pertama, kedua dan ketiga pengumpulan sampel urin ketika betina telah dalam keadaan estrus. Sehingga perbedaan antara referensi PC dan moving PC diurutkan untuk setiap kondisi pengukuran yang digunakan sebagai indeks untuk monitoring. Indeks Ai berhubungan dengan E1G sehingga digunakan untuk mendeteksi fluks hormon dalam sampel urin.

Ai = 1 - | wiTw0 | Persamaan indeks MPCA: dimana Ai = indeks MPCA wi = penghitungan proses pertama PC dengan langkah dari 9 spektrum yang diukur berturut-turut dari 3 sampel urutan waktu, dan w0 = referensi pemuatan proses pertama PC dihitung dengan 9 spektrum diukur dari 3 sampel urutan waktu yang pertama.   Untuk mengevaluasi hubungan antara konsentrasi E1G dan indeks MPCA, dihitung koefisien korelasi Pearson (r) dan Probabilitas (P) nilai <0,01 ditetapkan sebagai nilai yang sangat signifikan. 

Gambar 6. Data spectra urin pada PCA yang menunjukkan panjang gelombang dari 1100-2432 nm (kecuali dari jarak 1884-2012) adalah plot tingginya konsentrasi E1G dari 21-23 Maret, adalah yang lainnya.

 MPCA melihat bahwa perubahan komponen urin dapat dideteksi dengan pemantauan proses komponen utama (PC).  Tinggi koefisien pada proses PC1 ditemukan di 1427, 1500, 1695, 1728, 2200 dan 2295 nm. Panjang gelombang ini berhubungan dengan tinggi koefisien di vektor regresi. 

Gambar 7. Hasil pemantauan pada index MPCA dan konsentrasi E1G

Perubahan indeks MPCA diilustrasikan pada Gambar. 7. Hasil: Koefisien korelasi Pearson (r) antara konsentrasi E1G dan indeks MPCA adalah r = 0,81 (P <0,01) (n = 50). Indeks MPCA menunjukkan peningkatan yang tepat sebelum konsentrasi E1G mulai meningkat. Indeks juga turun tajam sesuai dengan menurunnya konsentrasi E1G yang menunjukkan ovulasi.

Hasil menunjukkan bahwa MPCA memberikan hubungan yang baik dengan konsentrasi E1G, yaitu, koefisien korelasi tinggi yang diperoleh antara data spektral dan referensi. Penelitian lebih lanjut memiliki kemungkinan untuk meningkatkan metode MPCA untuk menentukan waktu yang tepat dalam ovulasi.

KESIMPULAN Hasil menunjukkan bahwa data spektral mampu memberikan informasi tentang E1G dalam sampel urin sehingga spektrum IMD memiliki potensi untuk memperkirakan tempat estrus di panda raksasa betina. Hal ini dikarenakan, IMD dapat menemukan waktu yang optimal untuk berkembangbiak lebih cepat dan lebih mudah daripada EIA. Sehingga teknik ini dapat berguna untuk spesies yang terancam punah.

SEKIAN TERIMA KASIH