Uji Mikrobia Dalam Pangan

Mikrobia pada bahan makanan Terdiri dari berbagai spesies yang berasal dari berbagai lingkungan Populasinya tergantung dari penerapan proses sanitasi, proses pengolahan dan kontrol yang digunakan untuk membunuh mikrobia (metoda preservasi)

Tujuan melakukan analisa mikrobiologi Menentukan jenis dan sumber kontaminan Evaluasi proses sanitasi, penanganan bahan dasar dan proses pengolahan Menentukan kualitas mikrobiologis makanan Menentukan umur simpan makanan

Kriteria mikrobiologis makanan Standard – bagian dari regulasi Spesifikasi – untuk spesifikasi purchasing Guideline – digunakan untuk monitoring proses atau sistem

Metoda Kuantitaif Enumerasi atau estimasi langsung atau tidak langsung Aerobic Plate Counts (standard plate counts untuk dairy products), anaerobic counts, psychrotrophic counts, thermoduric counts, coliform counts, S. aureus counts, yeast and mold counts.

Enumerasi langsung Microscopic Counts CFU – Colony Forming Unit Nonselective agar media (PCA) Nonselective differential agar media Selective agar media Selective differential agar media

Enumerasi tidak langsung MPN Dye reduction test Pengenceran - nonselective media cair – jarang digunakan

Metoda Kualitatif Bakteri patogen (positif atau negatif) Salmonella, E. coli O157:H7, Clostridium botulinum, Listeria dll

Metoda Cepat ELISA Nucleic Acid Probe

Stardard mikrobiologi pada susu Susu segar Grade A SPC = 1x105 Susu pasteurisasi Grade A SPC = 2x104 dan coliform 10

Populasi mikrobia pada bahan makanan 7 SPOILAGE 6 5 Perlakuan 1 D mematikan mikrobia 90% 4 Awal 106, mati 90% 3 Yang masih hidup 10% x 106 = 105 2 1 Pasteurisasi – sublethal treatment 0 (5-6 D) -1 -2 -3 Sterilisasi komersial – konsep 12 D -4 (Penurunan jumlah mikrobia 12 log cycle) -5 Awal 106 sel/g – akhir 10-6 sel/g -6 Log jumlah sel

Uji mikrobiologi pada bahan makanan 7 Total mikrobia (bakteri, jamur, yeast) 6 Plate Count 5 4 3 2 Bakteri indikator : Coliform/E.coli 1 MPN -1 Bakteri patogen -2 Media resusitasi -3 Media diperkaya -4 Media selektif -5 Isolasi dan identifikasi -6 Log jumlah sel

Dilution and Plate Count (1)

Dilution and Plate Count (2)

Deteksi mikrobia pada makanan Total mikrobia (bakteri, yeast, jamur/mold) Bakteri indikator Coliform, fecal coliform, E. coli, Grup Enterobacteriacea Enterococci Bakteri pathogen Classical pathogen (Salmonella, Shigella, EPEC E. coli Emerging pathogen (Vibrio, Listeria monocytogenes, Yersinia, Campylobacter jejuni, dll) Kriteria bakteri indikator dan pathogen Berkaitan dengan feses dan pathogen enterik Level/rasio eksistensinya pada feses, bakteri indikator dan enterik Resistensinya terhadap lingkungan (habitat) alami (feses dan makanan) Resistensinya terhadap berbagai kondisi (proses dan penyimpanan makanan) Waktu yang dibutuhkan untuk deteksi

Prosedur Sampling Gunakan wadah yang steril Jaga tangan selalu bersih dan kering Jangan membalik atau menjatuhkan tutup botol Jangan memasukkan plastik sampel yang belum steril kedalam saku baju Jangan mengkontaminasi bagian atas ataupun bagian dalam plastik sampel. Cuci peralatan sampling sebelum digunakan Isi didalam wadah tidak lebih dari 2/3 atau 3/4 –nya Jangan memegang wadah (belum tertutup) melewati permukaan sampel ketika sampel tersebut dipindahkan Dinginkan sampel pada suhu 0-4,4oC Pindahkan sampel dalam wadah untuk pengiriman ke laboratorium Setelah digunakan, kembalikan wadah sampel ke laboratorium untuk disterilkan kembali

Standard Plate Count (SPC) Standard di dalam equipment, material dan inkubasi Equipment – tempat kerja, kabinet, refrigerator, termometer, transfer pipet, botol untuk pengenceran, cawan Petri, timbangan, waterbath, autoclave, inkubator, dll Penyimpanan sampel suhu 4,4 C, waktu pengujian < 36 jam Media – Standard method agar (Plate count Agar) Pancreatic digest of casein (tripton) 5,0 g Yeast extract 2,5 g Glucose 1,0 g Agar 15,0 g DW s/d 1 liter pH (setelah sterilisasi) 7.0 + 0,2 Inkubasi 32 + 1C, 48 + 3 jam untuk mesofilik Untuk termofilik : 55 + 1 C selama 48 jam, sebagai TBC/ml atau g Untuk psikrofilik : 7 + 1 C selama 10 hari, sebagai PBC/ml atau g

Bakteri coliform Bentuk batang pendek, Gram negatif, aerob dan fakultatif anaerob, tidak membentuk spora dapat menfermentasi laktosa & menghasilkan gas pada suhu 32 C selama 48 jam Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter, Erwinia Bakteri indikator- berasosiasi dengan jalur intestin, keberadaannya dalam makanan – merupakan kontaminasi dari jalur intestin (feses) Uji coliform – terjadinya (re)kontaminasi & evaluasi proses sanitasi, baik pada proses pemerahan susu, setelah pasteurisasi, penyimpanan, dan proses-proses berikutnya

Presumptive test – Positive Koloni berwarna merah gelap, diameter 0,5 mm muncul setelah 24 + 2 jam inkubasi suhu 32 C pada media VRBA (violet red bile agar) Pada media 2% brilliant green lactose bile broth (BGLB) terbentuk gas setelah fermentasi 48 + 3 jam pada suhu 32 C Complete test – Positive Pada Eosin Metilen Blue (EMB) agar, 32 C, 24 jam – koloni berwarna hijau metalik Pada laktosa cair, 32 C, 48 jam – memproduksi asam dan gas Pada nutrien agar, 32 C, 24 jam - Gram negatif, batang pendek, dan tidak membentuk spora

Coliform test – pada media padat Media yang digunakan VRBA (Violet red bile agar) 1 ml sampel (atau diencerkan terlebih dahulu) dimasukkan ke dalam cawan dan ditambah 10-15 ml media yang masih mencair (atau 4 ml sampel ditambah 15-20 ml media), tergantung dari perkiraan populasi coliform Dilapisi lagi dengan media VRBA untuk mencegah pertumbuhan koloni di permukaan Inkubasi (posisi terbalik) selama 24 + 2 jam pada 32 C Koloni coliform berwarna merah gelap diameter 0,5 mm

Salmonella pada bahan makanan Salmonella merupakan bakteri pathogen Pada proses pengolahan yang baik jumlah Salmonella dapat serendah 1 sel/25 gram sampel, atau tidak terdeteksi Salmonella - mengalami injur Deteksi lebih kompleks - AOAC 1992, 1995

Tahapan isolasi dan identifikasi Salmonella 1. Pre-enrichment Menyehatkan kembali sel yang luka karena proses pengolahan dan penyimpanan makanan sehingga dapat mencapai kondisi fisik yang stabil 2. Selective Mendukung pertumbuhan bakteri Salmonella dan enrichment menekan pertumbuhan bakteri kompetitif lain 3. Uji selektif padat Salmonella dapat tumbuh dan bakteri non Salmonella terhambat 4. Uji pendugaan Uji penetapan terhadap koloni Salmonella yang tipikal 5. Karakterisasi Menggunakan Kit diagnostik komersial biokimiawi 6. Uji serologi Identifikasi dan klasifikasi serotype Salmonella