Disampaikan pada MK. Teknik Bioesai 5-lipoxygenase Assay Disampaikan pada MK. Teknik Bioesai Disusun oleh : Syamsul Hidayat (G451130231) Saadatul Husna (G451130121) Nurhajawarsi (G451130071) Yulius Dalangapa (G451130011) Wahyu Aji Setianto (G451120031)
5-lipoxygenase Pathway 5-Hydroperoxyeicosatetraenoic Acid Arachidonic Acid 5-Lipoxygenase 5-Hydroperoxyeicosatetraenoic Acid (5-HPETE) 5-Lipoxygenase Leukotriene A ( LTA4 ) LTA4 Hydrolase Leukotriene B4 ( LTB4 ) Inflammation
Metode Bahan Alat Na2HPO4.2H2O Peralatan gelas Asam Arakidonat 6 mM Enzim 5-lipoksigenase DMSO Metanol Etanol 2-metoksi etanol KOH 0.54 M NH4OH 0.54 M NaOH 0.1 M Nitrogen Akuades Alat Peralatan gelas Stopwatch Pendingin pH meter Neraca analitik Mikropipet Spektrofotometer UV/VIS
Prosedur Penelitian Pembuatan Buffer Fosfat Preparasi Substrat Preparasi Sampel Pengukuran Aktivitas Enzim
Pembuatan Buffer Fosfat Larutkan dengan 187,5 mL aquades Timbang 3,9 g Na2HPO4.2H2O Cek pH pada 250 C Atur pH pada 7,4 Dengan penambahan NaOH 0,1 M 250 mL Simpan pada 40 C
Dibuat variasi konsentrasi 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm P r e p a r a s i S a m p e l Timbang 25 mg Artemetin Dilarutkan dengan DMSO 0,1 M dan Aquabidest Diimpitkan hingga 25 ml Dengan Aquabidest Dibuat variasi konsentrasi 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm 25 mL Larutan stok 1000 ppm Sampel uji merupakan senyawa murni Artemitin (Choundhary, 2009)
Preparasi Subsrat 0,2 mL asam arakidonat + 1 mL metanol Larutan Stok disimpan pada -200 C 50 mL Ambil 20 mL + 20 mL KOH + Buffer Fosfat 10 mL Larutan Substrat
Pengukuran Aktivitas Enzim Blanko 0,95 ml PBS 0,1M pH 7,4 50 µL DMSO Ukur pada 234 nm selama 2-3 menit
Pengukuran Aktivitas Enzim Kontrol Positif : Baicalein 0,95 ml PBS 0,1M pH 7,4 Larutan enzim 100 µL + Baicalein 50 µL Inkubasi selama 10 menit pada 25 0 C Ukur pada 234 nm selama 2-3 menit Tambahkan Substrat 50 µL Variasi Konsentrasi 20, 40, 60, 80, 100 ppm
Pengukuran Aktivitas Enzim Kontrol Negatif 0,95 ml PBS 0,1M pH 7,4 Larutan enzim 100 µL Inkubasi selama 10 menit pada 25 0 C Ukur pada 234 nm selama 2-3 menit Tambahkan Substrat 50 µL
Pengukuran Aktivitas Enzim Sampel 0,95 ml PBS 0,1M pH 7,4 Larutan enzim 100 µL + Bahan Uji 50 µL Inkubasi selama 10 menit pada 25 0 C Ukur pada 234 nm selama 2-3 menit Tambahkan Substrat 50 µL Variasi Konsentrasi 20, 40, 60, 80, 100 ppm
Persen inhibisi dihitung dengan persamaan berikut: % 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑠𝑖= 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 −𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠 (𝑢𝑗𝑖) 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛 (𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙) 𝑥 100
TERIMAKASIH
Lampiran