Protease Inhibition Assays Anggraeni Ramadhaleta Ida Ayu Suci Nanda OLEH : Aryani Sabir Hanifullah Habibi

Pendahuluan Protease Penyakit pencernaan pembekuan darah fisiologis sel pencernaan pembekuan darah kontrol tekanan darah respon imun Penyakit Antioksidan merupakan mek Kanker, emfisema paru, dystrophy otot, arthritis, pankreatitis

Jumlah kromofor bebaskan sebanding dengan aktivitas enzim Substrat kromogenik protease memiliki urutan asam amino spesifik yang terikat dengan kromofor seperti p-nitroaniline PRINSIP ESAI Aktivitas spesifik protease terhadap substrat menyebabkan pelepasan kromofor yang diukur sebagai peningkatan absorbansi dalam spektrofotometer Jumlah kromofor bebaskan sebanding dengan aktivitas enzim

BAHAN DAN ALAT BAHAN ALAT HCl 5 M Buffer Tris-HCl kons. 50 mM pH 8.6 Buffer Tris-HCl 0,4 M pH 8.6 Enzim Elastase DMSO Air bebas ion Substrat: Suc (Ala)3-p-nitroanilide kons. 1.55 Sampel uji: Senyawa X Pipet mikro Labu takar Gelas beaker pH meter Spektrofotometer UV-Vis Tabung Eppendorf Plat mikro 96 sumur (flat bottom) Timer

PROSEDUR ESAI

PROSEDUR ESAI 1. Buffer Tris-HCl HCl 5 M , pH larutan menjadi 8.6 1.2114 gram Tris (hydroxymethyl)-aminomethane Air bebas ion Larutan stok 10 mL

Pengenceran untuk 36 x uji PROSEDUR ESAI 2. Buffer Tris-HCl 0,4 M Pengenceran untuk 36 x uji Ulangan Variasi Konsentrasi Total Esai Kontrol Positif ( buffer+enzim+ ONO-6818+Substrat ) 3 5 15 Bahan uji ( buffer+E+Ekstrak Kerang Lunak+S ) Blanko (buffer, enzim, DMSO+S) 1 Kontrol Negatif (S+Buffer+E+DMSO) TOTAL 36

PROSEDUR ESAI 2. Buffer Tris-HCl 0,4 M Volume esai buffer untuk 36 x uji x 50 µL = 1,8 mL (1800 µL) Larutan stok dibuat sebanyak 10 mL diambil dari larutan stok 5 M. Sehingga volume larutan stok yang diencerkan sebanyak : V1.M1 = V2.M2 V1 = (10 mL x 0,4 M) / 5 M = 800 μL atau 0.8 mL

PROSEDUR ESAI 2. Buffer Tris-HCl 50 mM Volume esai buffer untuk 36 x uji Untuk membuat larutan Tris HCl 50 mM dalam 10 mL dibuat dari larutan 1 M yang dibuat dari larutan induk 5 M. V1.M1=V2.M2 V1= (10 mL X 1 M)/5 m V1= 2 mL x 50 µL = 1,8 mL (1800 µL) Larutan stok dibuat sebanyak 10 mL diambil dari larutan stok 1 M Sehingga volume larutan stok yang diencerkan sebanyak : V1.M1 = V2.M2 V1 = (10 mL x 50 mM) / 1 M = 0,5 mL

3. Pembuatan Larutan Enzim Elastase 0,6 unit/mL PROSEDUR ESAI 3. Pembuatan Larutan Enzim Elastase 0,6 unit/mL Larutan Stok Enzim yang tersedia 6 unit/mL. V1.M1=V2.M2 V1=(0.6 u/mL x 2mL)/6 u/mL V1= 0.2 mL atau 200 μL 200 μL stok ditambahkan 1800 μL buffer

4. Pembuatan variasi konsentrasi sampel PROSEDUR ESAI 4. Pembuatan variasi konsentrasi sampel Stok awal larutan sampel 0.001 gr sampel dilarutkan dalam 1 mL DMSO Konsentrasi=1000 μg/mL . Diencerkan menjadi 200 μg/mL V1xM1=V2xM2 ; V1=(1000 mLx 200 μg/mL )/1000 μg/mL V1=200 μL larutan stok ditambah 800 μL buffer Variasi konsentrasi sampel 200;100;50;25;12,5 μg/mL Pengenceran bertingkat dilakuakan di dalam mikroplat sumur 96

4. Pembuatan variasi konsentrasi kontrol positif PROSEDUR ESAI 4. Pembuatan variasi konsentrasi kontrol positif Stok awal larutan sampel 0.001 gr sampel dilarutkan dalam 1 mL buffer Konsentrasi=1000 μg/mL . Diencerkan menjadi 200 μg/mL V1xM1=V2xM2 ; V1=(1000 mLx 200 μg/mL )/1000 μg/mL V1=200 μL larutan stok ditambah 800 μL buffer Variasi konsentrasi sampel 200;100;50;25;12,5 μg/mL Pengenceran bertingkat dilakuakan di dalam mikroplat sumur 96

4. Pembuatan Larutan Substrat Suc-(Ala) 3-p-nitroanilide 1,55 mM PROSEDUR ESAI 4. Pembuatan Larutan Substrat Suc-(Ala) 3-p-nitroanilide 1,55 mM M= molaritas n= mol V= volume massa substrat yang harus ditimbang adalah: massa= 6,9967 mg (dilarutkan dalam 10 mL buffer Tris-HCl )

Pengujian 96 well

KONTROL NEGATIF MIX 100 µL DMSO 50 µL assay buffer Tris HCl 0,4 M 50 µL larutan enzim protease 15 menit Inkubasi 37 oC, 30 menit Inkubasi 37 oC, 30 menit Inkubasi 37 oC, 30 menit MIX Absorban pada 410 nm 1 00 µL larutan substrat 100 µL DMSO

BAHAN UJI MIX 100 µL Larutan Ekstrak sampel dalam DMSO 50 µL assay buffer Tris HCl 0,4 M 50 µL larutan enzim protease 15 menit Inkubasi 37 oC, 30 menit Inkubasi 37 oC, 30 menit Inkubasi 37 oC, 30 menit MIX Absorban pada 410 nm 100 µL Larutan Ekstrak sampel dalam DMSO 1 00 µL larutan substrat

KONTROL POSITIF MIX 100 µL Substrat 50 µL assay buffer Tris HCl 0,4 M 50 µL larutan enzim protease 15 menit Inkubasi 37 oC, 30 menit Inkubasi 37 oC, 30 menit Inkubasi 37 oC, 30 menit MIX Absorban pada 410 nm 1 00 µl ONO 100 µL Substrat

BLANKO MIX 100 µl DMSO 1 00 µL larutan substrat 50 µL assay buffer Tris HCl 0,4 M 50 µL larutan enzim protease Inkubasi 37 oC, 30 menit Inkubasi 37 oC, 30 menit Inkubasi 37 oC, 30 menit MIX 15 menit 100 µl DMSO Absorban pada 410 nm

Kalkulasi persentasi Penghambatan