Universitas Mulawarman PENGUJIAN TOKSITAS Oleh Drs.Sudrajat,S.U. Dosen pada : 1). FMIPA, 2). Fak.Kedokteran, 3). Fak. Kesmas, 4). Program S-2 Ilmu Lingkungan Universitas Mulawarman Samarinda 2005

- Kehadirannya di dalam lokasi organ sasaran - Kadar yang efektif Toksisitas Toksisitas adalah kapasitas untuk menimbulkan kerusakan. Suatu substance dapat menyebabkan kerusakan ditentukan oleh ; - Kehadirannya di dalam lokasi organ sasaran - Kadar yang efektif Toxicity is the capacity to cause injury. In order for a substance to cause injury, it must be present at its site of action at an effective dose. All substances at low enough levels are not toxic. Most substances at high enough levels are toxic.

Measurement of Toxicity "All substances are poisons; there is none which is not a poison. The right dose differentiates a poison from a remedy." - Paracelsus Toxicon = primary toxic agent Measurements of Toxicity Toxicology is the study of the adverse effects of xenobiotics (or foreign chemicals). The use of poisonous concoctions for various purposes predates history. Prior to the renaissance, toxicology was largely descriptive consisting of lists of animals, plants and minerals that had deleterious effects. The father of modern toxicology is Paracelsus, who lived from 1493 to 1541. He focused on the "toxicon" (or the primary toxic agent) as a discrete chemical as opposed to the earlier focus on concoctions. Paracelsus introduced the modern idea that: "All substances are poisons; there is none which is not a poison. The right dose differentiates a poison from a remedy." Unfortunately, this concept of Paracelsus, like many modern scientific concepts, is often misunderstood and/or not accepted in modern American culture.

Toxicity testing Acute toxicity test Short time frame exposure (96h) LC50, TLM (median tolerance limit) EC50 (effective concentration) Chronic toxicity test Longer time frame exposure (1 week to 3 years) Endpoints are reproduction (brood size) physiology, behavior, biochemistry More ecologically relevant

Ecosystem Tests (microcosms, mesocosms) Design (4 reps X 3 treat., 3 rep X 4) Time = 1 – 2 years Endpoints are Biomass Diversity Species richness Etc.

LC50 Aquatic organisms- add insecticide/pollutant to water Baits LC50 (lethal concentration) not LD50 (lethal dose) Baits Oral LC50 Ad libitum- dose not controlled True Oral LC50 Small bait entirely consumed Place insecticide directly into mouth/gut Some insects are not easily tested by topical application or injections. Toxicity to aquatic organisms such as mosquito larvae is tested by adding the insecticide to the water. In this case, the measure of toxicity is not LD50 but LC50 or the concentration of toxin that kills 50 % of the population. Oral LC50 is measured when the insecticide is used as a bait. In LC50 testing, a distinct disadvantage is the inability to control the dose given to an individual, particularly if the dose is given as a concentration in diet that is eaten ad libitum. An oral LD50 can be obtained by offering the insect the toxin in a small amount of bait which is entirely consumed or with large insects such as some caterpillars by placing the dose directly into the midgut through the use of a syringe.

Toxicity- Condition Dependent Affected by environment and physiology Age Sex physiological condition Diet Temperature Humidity route of administration length of exposure species used Measurements of toxicity are contingent upon the conditions under which they were determined. A number of environmental and physiological parameters affect the toxicity of a compound. Among these are age, sex and physiological condition of the test organism, diet, temperature, humidity, route of administration, length of exposure and the species used.

AQUATIC TOXICOLOGY PESTICIDE REGISTRATION BIOMONITORING SEDIMENT TOXICITY Whole Sediment Spiked Sediment Marine & Freshwater BIODEGRADATION Closed Bottle CO2 productivity ION BALANCE STUDIES BIOMONITORING Acute & Chronic Marine & Freshwater Stormwater TOXICITY REDUCTION EVALUATIONS DRILLING FLUID TOXICITY PRODUCT SCREENING

AQUATIC TOXICOLOGY Organisms cultured at Stillmeadow MARINE SPECIES Menidia beryllina (Silverside Minnow) Mysidopsis bahia (Mysid) Cyprinodon variegatus (Sheepshead Minnow) Acartia tonsa (Marine Copepod) Skeletonema costatum (Marine Algae) Leptocheirus plumulosus (Marine Amphipod) Brachionus plicatilis (Marine Rotifer)

AQUATIC TOXICOLOGY Organisms cultured at Stillmeadow FRESHWATER SPECIES Pimephales promelas (Fathead Minnow) Ceriodaphnia dubia (Water Flea) Daphnia pulex (Water Flea) Daphnia magna (Water Flea) Selenastrum capricornutum (FW Algae)

AQUATIC TOXICOLOGY Other test organisms used* MARINE SPECIES Palaemonetes pugio (Grass Shrimp) Corophium volutator (Intertidal Amphipod) Ampelisca abdita (Marine Amphipod) FRESHWATER SPECIES Oncorhynchus mykiss (Rainbow Trout) Oryzias latipes (Rice Fish/Japanese Medaka) Lepomis macrochrpus (Blue Gill) Hyallela azteca (Freshwater Amphipod) Chironomus tentans (Midge Larvae) Cyprinus carpio L Tilapia nilotica * Cultured off site

PENGUJIAN TOKSITAS AKUT TATA KERJA PENGUJIAN TOKSITAS AKUT a. Tahap pemeliharaan organisme uji b. Aklimatisasi c. Tahap Perlakuan c.1.uji Pendahuluan c.2.uji Sesungguhnya

Dicari dari sumber bibit yang sama dengan a. Tahap Pemeliharaan organisme Uji Dicari dari sumber bibit yang sama dengan umur, keadaan lainnya homogen Organisme yang mati dan variasi yang mencolok dikeluarkan dari populasi

Dipersiapkan rangkaian bejana uji untuk 5-6 b. Tahap Aklimasi organisme Uji Dipersiapkan rangkaian bejana uji untuk 5-6 variasi dosis yang akan diuji Setiap organisme uji sebanyak 10-20 ekor dipelihara dalam bejana uji ditempat mana akan dilakukan percobaan selama minimal 3-4 hari, tergantung kepada besar dan sifat organisme uji tersebut - Upayakan kerapatan hewan uji jangan terlalu rapat dan jangan terlalu jarang

Untuk pengujian terhadap ikan, ikan uji tidak diberi pakan dua hari sebelum perlakuan Jika selama aklimasi, mortalitas organisme uji tidak melebihi 3 % selama 48 jam, maka kegiatan perlakuan dapat diteruskan.

c. Tahap Perlakuan - Tahap ini dibedakan atas 2 tahap, yakni : c.1. Uji pendahuluan ( Range finding test/ Exploratory test) c.2. Uji sesungguhnya ( Full scale test/ Definitive test)

c.1. Uji pendahuluan ( Range finding test/ Exploratory test) ( Rand et al., 1976; Deptan,1983). Uji ini bertujuan untuk menentukan kadar ambang lethal, yakni ambang atas (LC100-24 jam) dan ambang bawah ( LC0-48 jam). Semua bejana uji diberi tanda secara acak untuk memperoleh kadar perlakuan yang akan dilakukan dengan cara pengundian Deretan konsentrasi yang dipakai di dalam uji pendahuluan adalah suatu urutan kadar bahan uji dengan basis angka 10, misalnya 10 -1 ; 10 -2 ; 10 – 3 ; 1 , 10 1 ,10 2 ,10 3, 10 4 ..... Dan seterusnya mg/lt;untuk menemukan kadar ambang atas ( LC-24 jam) diberi simbol N dan kadar Ambang Bawah ( LC-48 jam) dg simbol n.

Tabelkan hasil pengamatan ke dalam tabel pengamatan berikut - Tolok ukur yang diamati adalah jumlah organisme uji yang mati setiap jam selama 24 jam dan 48 jam dan dihitung jumlah akumulatifnya pada 24 jam dan 48 jam sehingga diperoleh Nilai ambang batas ( LC100-24 jam) dan ambang bawah ( LC0-48 jam) Rasio kematian organisme uji didapat dari jumlah organisme uji yang mati per bejana dibagi dengan jumlah total semula pada setiap kadar perlakuan Tabelkan hasil pengamatan ke dalam tabel pengamatan berikut Hasil akhir dari kegiatan uji pendahuluan ini adalah diperolehnya nilai kisaran konsentrasi kritis zat racun terhadap organisme uji yaitu nilai LC100-24 jam dan LC0-48 jam.

Range Kadar Perlakuan Pendahuluan Kadar Terendah dimana Kadar terbesar dimana Organisme hidup 100 % ( n) semua organisme uji Dalam waktu 48 jam seluruhnya mati dalam ( LC0-48 jam) waktu 24 jam( LC100-24 jam) = N KISARAN KONSENTRASI KRITIS K1 K2 K3 ………………………………………… Kn ------------------------------------------------------------------------------------------- 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 ( ppm)

Jumlah Organisme uji yang mati dg interval 24 jam Tabel Hasil Uji Pendahuluan daya racun substansi X terhadap Organisme Uji Konsentrasi Jumlah Organisme uji yang mati dg interval 24 jam 96 Jam Mortalitas 24 48 72 96 Kontrol 0.001 % 0.01% 0.1 % 1% Catatan : interval waktu pengamatan dapat dibuat per jam dan kumulatif kematian dapat dalam waktu 12 jam, 24 jam, dstnya. Tergantung kepada jenis organisme uji dan zat racunnya

- Berdasarkan hasil Uji Pendahuluan dapat dipilih c.2. Uji sesungguhnya ( Full scale test/ Definitive test) - Berdasarkan hasil Uji Pendahuluan dapat dipilih urutan Kadar Bahan Uji menurut Skala Logaritmik. Konsentrasi ditentukan dalam interval geometris yang diperoleh dengan rumus-rumus sebagai berikut : N a (1).log ----- = k ( log ---- ), dimana : n n N = Konsentrasi ambang atas ( LC100-24 jam) n = Konsentrasi ambang bawah ( LC0-48 jam) k = Jumlah konsentrasi yang akan diuji ( mis. 5 variasi) yakni a, b, c, d dan e. a = Konsentrasi terkecil dalam deretan konsentrasi yang akan ditentukan setelah n

a b c d e N (2). --- = -- = --- = ----- = ---- = ----- n a b c d e Dengan rumus 1, dapat dihitung nilai konsentrasi a ( Konsentrasi terkecil 0, selanjutnya dapat dihitung berturut-turut konsentrasi b, c, d dan e dengan rumus 2.

Contoh : Diperoleh nilai N = 10 -1 ppm dan n = 10 -0 ppm Jumlah interval perlakuan yang akan dilakukan sebanyak 5 ( k=5) Maka nilai a dapat dicari sbb: N a Log --- = k ( log ------ ) n n log 0.1 – log 0 = 5 ( log a – log 0) -1 – 0 = 5 log a – 0 -1 = 5 log a - 0 1 log a = ----- = 0.2 5 a = 10 0.2 dengan kalkulator; 0.2 shift log = a = 1.58

a b c d e N --- = -- = --- = ----- = ---- = ----- n a b c d e Menghitung nilai b : a b 1.58 b --- = -- ----- ------ = ------- = n a 1 1,58 1.58 x 1.58 b = ------------- = 2.50 1 Menghitung nilai c : b c 2.50 C a b 1.58 2,50 2,50 x 2.50 b = ------------- = 3,96 dan seterusnya untuk kadar d, e dan f .

Tabel Pengamatan Hasil uji Pendahuluan jumlah ikan yg mati interval 24 jam Konsentrasi 24 48 72 96 Prosentase Kontrol 0,1 % 1 % 10 % 10 100 100 %

Tabel Pengamatan Hasil uji Sesungguhnya jumlah ikan yg mati interval 24 jam Konsentrasi 24 48 72 96 Prosentase Kontrol 0,1 % 1 % 10 % 1 12,5 56 % 37,5 100 % 2 60 100

ANALISIS DATA Menggunakan Kertas Grafik Semilogaritma, dimana absisnya (Y) berisikan data % Jumlah organisme uji yang masih hidup dan ordinatnya berisikan data log konsentrasi perlakuan ( x) Menggunakan persamaan garis regresi log konsentrasi terhadap Probit kematian organisme uji ( Probit Analysis) Menggunakan persamaan garis regresi log konsentrasi terhadap Logit kematian organisme uji ( Logit Analysis) 4. Menggunakan Soft WARE EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM 5. dll

Ada cara lain yang lebih mudah yakni menggunakan skala Duodoroff, et al ( 1951) yakni skala konsentrasi yang dapat dipergunakan untuk menentukan variasi kadar perlakuan suatu bioassay dengan dasar interval progressive bisection pada suatu skala logaritmik.

1 -

ANALISIS DATA Menggunakan Kertas Grafik Semilogaritma, dimana absisnya (Y) berisikan data % Jumlah organisme uji yang masih hidup dan ordinatnya berisikan data log konsentrasi perlakuan ( x) Menggunakan persamaan garis regresi log konsentrasi terhadap Probit kematian organisme uji ( Probit Analysis) Menggunakan persamaan garis regresi log konsentrasi terhadap Logit kematian organisme uji ( Logit Analysis) 4. Menggunakan Soft WARE EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM 5. dll

Contoh : Larutan yang berisi 200 mg zat per ml diberikan secara oral dan subkutan, pada beberapa kelompok tikus dengan berat 18-24 g dan masing-masing kelompok terdiri 10 ekor. Dari percobaan ini diperoleh hasil sebagai berikut :

Cara pemberian Dosis ( mg/20 g) Log dosis Angka kematian Prosentase Respon Probit Oral 90 1,954 3 30 4,48 100 2,000 4 40 4,75 110 2,041 8 80 5,84 Subkutan 60 1,778 1 10 3,72 70 1,845 6 5,25 1,945 9 6,28

Berdasarkan grafik dapat diketahui bahwa cara per oral menghasilkan log MLD = 1,990. Jadi MLD Oral = 97,7 mg/20 g berat badan atau 4,88 g/kg berat badan. Sedangkan cara subkutan menunjukkan log MLD = 1,848. Jadi MLD subkutan = 70,5 mg/20 g berat badan = 3,25 g/kg berat badan.

II. DASAR STATISTIKA ANALISIS HUBUNGAN DOSIS-KEMATIAN Penyelidikan hubungan dosis-kerja suatu racun dapat dilakukan dengan 2 cara, yakni : a). Mengubah-ubah dosis ( hubungan dosis- reaksi) - Jumlah objek yang menunjukkan efek tertentu akan bertambah sampai maksimum b). Mengubah-ubah dosis, mengukur intensitas kerja pada satu objek percobaan. - Intensitas efek yang bertambah

Gambaran bentuk hubungan antara dosis dengan jumlah individu dalam kelompok yang menunjukkan efek yang diinginkan dapat dlihat dalam Gambar berikut ( Sumber , Ariens et al., 1986. Toksikologi Umum, halaman 144).

Kurva Dosis-Respon Bentuk dasar hubungan dosis-respon dapat ditunjukkan dalam suatu grafik Harap diingat bahwa sumbu –X adalah logaritma, oleh karena itu tidak selalu memungkinkan untuk meneruskan plot tersebut sampai ke dosis nol Dari kemiringan plot dapat diperoleh informasi yang berguna dan dengan menggunakan intersepsi akan memberikan efek terhadap seluruh organisme Bentuk kurva tergantung sejumlah faktor, namun biasanya berupa turunan dari kurva gauss yang menjelaskan distribusi normal dalam sistem biologi

Bagian paling linier ditemukan antara 16 % dan 84 % dan bagian ini dapat digunakan untuk memprakirakan nilai LD50 Ciri khas dari kurva distribusi frekuensi ditunjukkan dalam prosentase populasi yang terletak dalam satu atau dua standard deviasi (SD) dari median ( M) atau disebut sebagai LETHAL CONCENTRATION 50 ( LC50). Dosis median adalah dosis yang membagi populasi menjadi dua bagian Sedangkan mode merupakan nilai maksimum dari frekuensi distribusi LD50 dapat dilihat dengan menarik garis horizontal pada unit probit ke arah garis dosis. Perpotongan garis vertikal dan horizontal adalah titik LD50.

Banyaknya individu yang menunjukkan efek ini dengan demikian merupakan fungsi dosis. Gambar …, menunjukkan % individu yang memberikan reaksi digambarkan secara linier terhadap dosis.Pada kurva demikian, dosis yang menyebabkan 50 % individu memberikan reaksi, digunakan sebagai besaran bagi aktivitas ( ED50) atau lethalitas ( kematian) ( LD50) dari senyawa racun yang diperiksa. Sampai saat ini dianggap, pada pembuatan gambar secara linier, akan terjadi distribusi no.rmal yang simetrik. Pada objek biologi hal semacam ini justru merupakan kekecualian dan bukan hal yang biasa. Dalam kenyataannya, lebih sering di dapat distribusi asimetri

Jika dalam hal ini, dosis digambarkan secara logaritmik, maka sering didapat lagi kurva yang dalam hal ini disebut distribusi log-normal. Kurva hubungan dosis –reaksi kematian yang berifat simetrik sangat ideal, karena perhitungan statistik harga yang diukur kemudian disederhanakan. Jelas bahwa kemiringan ( slope) kurva dosis-reaksi merupakan petunjuk adanya distribusi statistik harga di sekitar ED50.

PROSEDUR ANALISIS PROBIT Dalam rangka untuk melinierkan kurva dosis-respon, dapat dilakukan dengan cara pengubahan atau transformasi Untuk mengkonversi seluruh kurva sigmoid menjadi suatu hubungan linier dapat digunakan analisis probit, yang tergantung pada unit standard deviasi yang dipakai Kurva dapat dibagi menjadi berbagai standard deviasi dari dosis median Pada kurva normal di dalam suatu standard setiap sisi dari median kurva adalah linier dan mencakup 68 % individu Sebanyak 94,4 % individu diketahui berada dalam dua standard deviasi (SD) Kurva dosis-respon menghasilkan linier jika untuk dosis digunakan skala logaritmik

Transformasi ini menjadikan kita berurusan dengan garis yang benar-benar lurus, karena sekarang telah diubah menjadi Plot linier Penggunaan kertas grafik prbobit dapat membuat ploting data menjadi relatif mudah Dengan demikian dosis efektif atau EFFECTIVE DOSE 50 ( ED50) dapat ditentukan saat pengukuran respon biologis, farmakologis dan fisiologis.

Tingkat Kematian organisme uji diubah skalanya menjadi skala Probit Dosis perlakuan diubah menjadai skala logaritmik Selanjutnya diproyeksikan dalam kerta grafik dan kemudian dibuat garis lurus yang paling baik melalui titik-titik yang ada ( berdasarkan penglihatan) dan dosis pada garis ini yang menyatakan 50 % kematian dalam satu kelompok ( jadi probit = 5) ditentukan. Antilog titik ini disebut : median dosis letal ( Median Lethal dosis)= MLD dan merupakan ukuran kuantitatif toksisitas suatu zat racun terhadap organisme uji tersebut.

Jika titik-titik ( probit, log dosis) tersebar padahal dikehendaki harga MLD yang paling realiabel, maka harus ditentukan garis regresi yang menyatakan hubungan antara probit dan log dosis dengan memasukkan faktor W. Batas kesalahan MLD dapat diramalkan dari garis-garis regresi dan dapat dievaluasi berdasarkan varian titik-titik terhadap garis regresi.

Contoh : Larutan yang berisi 200 mg zat per ml diberikan secara oral dan subkutan, pada beberapa kelompok tikus dengan berat 18-24 g dan masing-masing kelompok terdiri 10 ekor. Dari percobaan ini diperoleh hasil sebagai berikut :

Cara pemberian Dosis ( mg/20 g) Log dosis Angka kematian Prosentase Respon Probit Oral 90 1,954 3 30 4,48 100 2,000 4 40 4,75 110 2,041 8 80 5,84 Subkutan 60 1,778 1 10 3,72 70 1,845 6 5,25 1,945 9 6,28

Berdasarkan grafik dapat diketahui bahwa cara per oral menghasilkan log MLD = 1,990. Jadi MLD Oral = 97,7 mg/20 g berat badan atau 4,88 g/kg berat badan. Sedangkan cara subkutan menunjukkan log MLD = 1,848. Jadi MLD subkutan = 70,5 mg/20 g berat badan = 3,25 g/kg berat badan.

Aquatic toxicity testing Daphnia (water flea) “White rat of aquatic toxicity testing” Daphnia toxicity test

Example problem Dose % alive 0 mg/L (control) 100 1 100 3 90 10 30 1 100 3 90 10 30 30 20 100 0

Today’s laboratory exercise Acute toxicity test – Daphnia pulex Use neonates (<24 h old) All females (parthenogenetic) Class will break up into 3 groups of 2 1 person in group will calculate dilutions, other will select neonate Daphnia

To count out Daphnia Work on light table, easier to see. Arrange 6 small plastic sample cups. Put 2-3 ml in each sample cup (large drop). Suck up Daphnia from brood container (2-3 at a time, neonates only). Express Daphnia into large drop. Note: take care to release Daphnia under water  if just drop in may get caught in surface tension and die Put 2-3 in 1st cup, 2-3 in next cup, until all cups have 10  random distribution will prevent putting all easiest to capture in 1st cup, next easiest all in 2nd cup, etc After have 10 in ea. Cup and test chambers are ready, carefully lower cup into test chamber and release animals under water. Record # dead/alive 24 and 48 hrs

Estimate LC50 If have at least two partial kills  use computer program If one or less partial kills  use probit paper