TK- 3003/3005 LAB TK I KONVERSI ENZYMATIC Pengolahan Pati Menjadi Sirop Glukosa Melalui Hidrolisis Enzim-Enzim Oleh RETNO GUMILANG DEWI PROGRAM STUDI TEKNIK KIMIA INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

Glucose Syrup dan Proses Pembuatannya Pengenalan Teknologi Proses Pengolahan Glucose Syrup dari Bahan Baku Pati Proses Produksi Glucose Syrup Menggunakan Enzym Flow Sheet Sistem Produksi Glucose Syrup Menggunakan Enzym Kondisi Operasi dan Pengaruhnya Terhadap Produk

Glucose Syrup dan Proses Pembuatannya Glucose Syrup adalah glukosa dalam bentuk sirop yang mengandung padatan ± 80% berupa glukosa dengan bermacam-macam oligosakarida Syrup ini dapat dimurnikan untuk menghasilkan konsentrat monosakarida nutritif dengan kadar sakarida tinggi. Glukosa padat adalah produk sirop glukosa yang memiliki kadar air ± 5% berat. Glucose Syrup dapat dihasilkan dari pati melalui hidrolisis. Sumber pati : di USA, pati diproduksi dari jagung; di Eropa, pati diproduksi dari jagung dan kentang; di Jepang, pati diproduksi dari ubi jalar; dan di negara-negara tropis sperti Indonesia/Thailand/Vietnam/Brazil, pati diproduksi dari ubi kayu dan dinamakan Tapioka. Glucose Syrup yang dihasilkan dari hidrolisis pati banyak mengandung dekstrosa, maltosa, dan dekstrin dan dapat digunakan sebagai pemanis.

Tabel 2 Karakteristik granula pati Proses Konversi Pati Menjadi Glucose Syrup PATI: cadangan karbohidrat berbentuk granula dan karakteristik spesifik Tabel 2 Karakteristik granula pati

Amilosa Amilosa Amilopektin

Amilosa Amilosa

Pengenalan Teknologi Proses Pengolahan Glucose Syrup Pati merupakan polimer yang tersusun atas unit glukosa yang dihubungkan oleh ikatan alfa-1,4-glikosidik dan ikatan alfa-1,6-glikosidik. Polimer pati terdiri atas dua tipe polimer polisakarida, yaitu amilosa dan amilopektin [Marchal, 2005]. Pati umbi-umbian memiliki lebih sedikit amilosa daripada pati yang berasal dari biji-bijian. Ubikayu memiliki 17% amilosa dan 83% amilopektin; Gandum memiliki 28% amilosa dan 82% amilopektin. Perbandingan komponen polisakarida ini mempengaruhi sifat fisik pati (viskositas, kelarutan dalam air, pembentukan gel, temperatur gelatinisasi, dan pembentukan lapisan film). [Flickinger, 1999] Amilosa merupakan polimer rantai lurus yang terdiri atas anhidroglukosa yang dihubungkan ikatan α-1,4-glikosidik. Di dalam air, amilosa membentuk struktur helix. Bila iodin ditambahkan pada larutan yang mengandung amilosa, maka iodin akan terperangkap dalam helix sehingga terjadi perubahan warna larutan menjadi biru/ungu (tergantung panjang molekul amilosa). [Chaplin, 2005] Amilopektin merupakan polimer bercabang yang terdiri atas unit anhidroglukosa (glukopiranosil) yang dihubungkan oleh ikatan α-1,6-glikosidik (percabangan) dan ikatan α-1,4-glikosidik yang membentuk rantai lurusnya [Chaplin, 2005]

Amilopektin

Pengenalan Teknologi Proses Pengolahan Glucose Syrup Hidrolisis pati dapat dilakukan melalui proses likuifaksi dan sakharifikasi. Berdasarkan katalis yang digunakan pada proses likuifaksi dan sakharifikasi metoda pembuatan glukosa melalui hidrolisis pati dikelompokkan menjadi: proses hidrolisis asam, proses asam – enzim, dan proses enzim – enzim. Pada proses hidrolisis asam, konversi pati menjadi glucose syrup dapat dilakukan secara kontinyu pada kondisi oerasi yang cukup ekstrim, yaitu temperatur 140 - 160oC dan pH 1,8 - 2,0. Proses ini banyak digunakan di masa lampau dan saat ini sudah mulai ditinggalkan walaupun masih ada beberapa industri kecil yang masih memanfaatkan teknologi ini. Kemudian dikembangkan proses konversi pati untuk perbaikan proses, yaitu melalui proses hidrolisis asam–enzim maupun enzim–enzim.

Pengenalan Teknologi Proses Pengolahan Glucose Syrup Proses Hidrolisis Asam: Hidrolisis dilakukan secara konvensional menggunakan HCl sebagai katalis melalui dua tahap hidrolisis, yaitu Tahap I: Dilakukan relatif singkat (5–8 menit) pada temperatur 140–160oC, 9 bar, dan pH 1,5–2,0. Tahap ini menghasilkan produk dengan DE 0,5–1,5%. Tahap II: Dilakukan dalam waktu 90–120 menit pada kondisi seperti Tahap I. Tahap ini menghasilkan produk dengan DE 10–15%. Proses hidrolisis asam tidak dapat menghasilkan produk Glucose syrup yang memuaskan tetapi hanya syrup dengan DE maksimum 10-15%, berwarna keruh, dan kadar abu tinggi. Sirop dengan nilai DE sangat rendah sulit atau bahkan tidak dapat dikristalkan sehingga harga jualnya rendah.

Proses Hidrolisis Asam Menggunakan katalis asam, biasanya HCl sekitar 0,12% dari berat pati Temperatur operasi 140-160oC dengan menggunakan steam bertekanan tinggi (9 bar) pH dijaga pada nilai 1,5-2,0 Perlu agen penetral  soda abu

Pengenalan Teknologi Proses Pengolahan Glucose Syrup Proses Hidrolisis Asam - Enzim: Pada proses asam–enzim, proses konversi pati menjadi glucose syrup dilaksanakan dalam dua tahap, yaitu: Pada tahap I: proses likuifaksi untuk menghidrolisis pati (batch atau kontinyu) dengan menambahkan asam seperti halnya hidrolisis asam. Pada tahap II: proses sakharifikasi dengan menambahkan enzim untuk melanjutkan pemutusan ikatan polimer yang dihasilkan proses Tahap I. Syrup yang dihasilkan melalui proses ini tidak dapat atau sulit dikristalkan. Nilai DE dari glucose syrup yang dihasilkan juga masih relatif rendah seperti halnya pada proses asam. Kemudian, mulai dikembangkan proses enzim–enzim yang menghasilkan glucose syrup dengan kualitas lebih baik dengan DE yang lebih tinggi dibandingkan dengan kedua proses sebelumnya. .

Proses Asam Enzim Pada tahap awal dilakukan penambahan asam  proses dapat dilakukan batch atau kontinu Dilanjutkan dengan penambahan enzim Enzim yang digunakan: α-amilase β-amilase Glukoamilase

Pengenalan Teknologi Proses Pengolahan Glucose Syrup Proses Enzim - Enzim: Pada proses enzim-enzim dihasilkan glucose syrup dengan kualitas cukup baik. Kadar glukosa pada syrup sangat tinggi (DE 96-98%) sehingga mudah untuk dikristalkan. Glucose syrup dengan kualitas seperti ini memiliki nilai jual tinggi. Konversi pati menjadi glukosa pada proses ini dilakukan melalui dua tahap, yaitu likuifaksi dan sakharifikasi secara batch pada kondisi yang tidak ekstrim. Tahap likuifaksi dilakukan pada tekanan atmosferik, temperatur 95 - 105oC, dan pH 6-6,5 selama selama 1-2 jam. Tahap sakarifikasi dilakukan pada tekanan atmosferik dan temperature 55–60oC selama 8 jam untuk mendapatkan DE cukup tinggi. Perbandingan kualitas sirop glukosa yang dihasilkan melalui hidrolisis enzim–enzim terhadap kualitas yang dihasilkan melalui hidrolisis asam dan hidrolisis asam–enzim disampaikan pada Tabel 1.

Pengenalan Teknologi Proses Pengolahan Glucose Syrup Di beberapa industri, terutama industri besar, saat ini banyak menggunakan proses enzimatik untuk proses hidrolisis pati daripada proses hidrolisis asam dengan pertimbangan: operasi dilakukan pada pH netral (6,0-7,5) dan temperatur yang tidak ekstrim pada tahap likuifaksi (95-105oC) dan tekanan atmosferik, konversi pati menjadi glukosa lebih tinggi dan kualitas produk lebih murni, pengendalian proses lebih mudah karena hanya perlu mengatur temperatur operasi reaktor pada kondisi tidak ekstrim, dan limbah cair yang dihasilkan relatif lebih sedikit dengan kualitas lebih baik dari pada menggunakan proses asam. Hasil hidorlisis pati menjadi glucose syrup sangat bergantung pada enzim yang digunakan, umumnya enzim α-amilase atau β-amilase untuk proses likuifaksi dan enzim glukoamilase untuk proses sakharifikasi

Enzim Hidrolisis Pati Dapat diperoleh dari tanaman, hewan dan mikroorganisme Lima kelompok enzim: 1.Endoenzim  amilase 2.Eksoenzim  glukoamilase 3.Enzim pemutus percabangan  pullulanase 4.Enzim isomerisasi  glukosa isomerase 5.Enzim Cyclodextrin Glikosiltransferase

Enzim α-amilase Termasuk endoenzim yang memutuskan ikatan α-1,4-glikosidik yang berlangsung secara acak Dihasilkan dari bakteri (Bacillus) dan jamur (Aspergillus) Kondisi optimum proses enzim bergantung pada mikroorganisme penghasil enzim Enzim yang dihasilkan B. subtilis memiliki kondisi optimal: 90oC dengan kandungan kalsium 300 ppm B. licheniformis enzyme memiliki kondisi optimal: 105-110oC dengan kandungan Kalsium 3,4 ppm

Enzim Glukoamilase Termasuk eksoenzim yang memutuskan ikatan α-1,6-glikosidik yang berada pada ujung rantai Dihasilkan oleh jamur Aspergillus sp. Dan Rhizopus sp. Kondisi optimum enzim ini adalah temperatur pada rentang 55-60oC dan pH = 4,2 sampai 4,5

Mekanisme Kerja Enzim Mekanisme hidrolisis pati oleh enzim bergantung pada jenis enzimnya

Tabel 1 Perbandingan kualitas glucose syrup pada berbagai proses Pengenalan Teknologi Proses Pengolahan Glucose Syrup Tabel 1 Perbandingan kualitas glucose syrup pada berbagai proses Proses (Katalis) Hidrolisis Asam Asam-Enzim Enzim-Enzim DE 38 42 28 % 63 % 98 Glukosa 12 % 18 % 5 % 37 % 96 % Maltosa 10 % 13 % 8 % 34 % 2 % Maltotriosa 16 % 1 % Oligosakarida 68 % 57 % 71 % Perlu dicatat bahwa hanya sirop glukosa dengan DE > 80% saja yang dapat dikristalkan dengan mudah dalam bentuk granula atau serbuk

proses penyiapan bubur pati dan gelatinisasi, proses likuifaksi, Proses Pengolahan Pati Menjadi Glucose Syrup Dengan Enzim Tahapan-tahapan Proses proses penyiapan bubur pati dan gelatinisasi, proses likuifaksi, proses sakarifikasi, proses filtrasi/klarifikasi, proses penghilangan atau penyisihan warna, proses penghilangan ion-ion (deionisasi), proses pemekatan (evaporasi) sirop glukosa yang meruapakan produk akhir

Proses Pengolahan Pati Menjadi Glucose Syrup Dengan Enzim

Penyiapan Bubur Pati Menurut literatur, hasil yang optimal dicapai dengan menggunakan umpan sebesar 30-40% berat bubur pati Produk akhir pada tahap ini adalah bubur pati yang memiliki viskositas tinggi. Setelah itu, pati mengalami tahap gelatinisasi

Proses Pengolahan Pati Menjadi Glucose Syrup Dengan Enzim Proses Gelatinisasi Granula pati mempunyai kapasitas penyerapan air dingin yang terbatas secara reversible, tetapi hidrasi lanjut dimungkinkan dengan peningkatan temperatur. Granula pati memiliki ketahanan tinggi terhadap penetrasi baik oleh air maupun enzim-enzim hidrolitik (ada ikatan hidrogen intra/inter-molekul). Ikatan hidrogen ini akan melemah dengan kenaikan temperatur  terjadi gelatinisasi Gelatinisasi adalah proses pembengkakan/swelling molekul secara ireversible karena molekul air masuk ke dalam struktur molekul (pati menjadi gel/pasta). Tahapan gelatinasi sangat menentukan keberhasilan hidrolisis pati secara enzimatik. Proses hidrolisis jauh lebih cepat jika dilakukan pada temperatur di atas temperatur gelatinasinya, yaitu 105–110oC. Selain temperatur, perbandingan air dan pati minimum harus terpenuhi untuk memperoleh gelatinasi yang sempurna

Fenomena Gelatinasi

Keunggulan Pati Tapioka untuk Proses Gelatinisasi Proses Pengolahan Pati Menjadi Glucose Syrup Dengan Enzim Keunggulan Pati Tapioka untuk Proses Gelatinisasi 1. kandungan pati tinggi (20-30%w/w), 2. kandungan protein dan mineral rendah, 3. Temperatur gelatinasi relatif rendah, dan 4. kelarutan amilosa lebih tinggi. Pembuatan pati tapioka dari ubikayu atau singkong melalui proses pencucian, pemarutan, penyaringan suspensi pati, pengeringan, dan penggilingan. Kualitas produk ditentukan oleh warna, kandungan air, dan kandungan serat dan aditif

Tahap Likuifaksi Proses pengenceran sampai terjadi hidrolisis parsial. Untuk menurunkan viskositas larutan yang telah mengalami gelatinisasi dan mencegah terjadinya retrogradasi Penambahan ion kalsium (Ca2+) bertujuan sebagai stabilisator pH serta menciptakan kondisi optimum bagi kerja enzim Produk yang dihasilkan: dekstrin, maltosa, maltotriosa, glukosa, dsb.

Tahap Sakarifikasi Proses pembentukan sakarida Menggunakan enzim glukoamilase Kondisi Operasi → pH 4,2-4,5 dan T=55-60oC Enzim glukoamilase dapat mempolimerisasi glukosa yang sudah terbentuk dengan reaksi balik membentuk maltosa atau isomaltosa dengan laju yang lebih rendah daripada reaksi hirolisis Reaksi balik bergantung pada konsentrasi substrat dan keaktifan enzim pada tahap akhir sakarifikasi

Proses Hilir Produk harus memenuhi spesifikasi tertentu. Standar produk yang berlaku sangat bervariasi, bergantung pada kebutuhan setiap konsumen Tahapan proses: Penghilangan padatan tersuspensi Penghilangan warna Penghilangan pengotor anorganik Pemekatan

Proses Hilir Konvensional Terdiri dari 3 tahap: 1.Penghilangan Padatan Tersuspensi Padatan tersuspensi terdiri dari lemak, protein, dan serat yang tidak terkonversi saat hidrolisis Penghilangan mud ini tidak dapat dilakukan dengan proses filtrasi biasa Teknologi: rotary vaccum filter press (RVFP) atau pressure leaf filter dengan menggunakan diatomite (diatomaceous earth) sebagai filter aid. Kedua teknologi ini membutuhkan banyak filter aid dan menghasilkan limbah padat

Proses Hilir Konvensional 2.PenghilanganWarna Warna ini berasal dari larutan enzim, selain itu juga berasal dari beberapa reaksi: Reaksi Lobry de Bruyn-van Ekenstein → degradasi glukosa menjadi senyawa polimer berwarna yang disebut melanoidins Reaksi Maillard → terjadi antara glukosa dengan asam amino, peptida, atau protein Metode: penggunaan material (karbon aktif)

Proses Hilir Konvensional 3.Penghilangan Ion Resin penukar kation dan anion Kapasitas pertukaran ion sangat terbatas → regenerasi dengan larutan asam dan basa pekat secara periodik (enam jam sekali) Kurang praktis, membutuhkan banyak bahan kimia, dan menghasilkan banyak limbah

Proses Hilir Modern Teknologi berdasarkan pemisahan molekular tekanan tinggi (nanofiltrasi) → ramah lingkungan dan tekanan tinggi Proses hilir (menyatu dengan proses utama) → daur ulang enzim → membran biorektor (kombinasi kelebihan hidrolisis enzimatik dan perpindahan massa selektif melalui membran) → beban pemurnian produk menjadi lebih ringan sebab tahap pemurnian produk menjadi lebih sederhana → modul hollow fiber

Analisis Produk Hidrolisis Ada dua tipe analisis → kualitatif & kuantitatif Analisis kualitatif 1.Tes Molisch → α-naftol & H2SO4 → cicin ungu kompleks (furfural) 2.Tes Benedict → reagen benedict → warna jingga-merah 3.Reaksi Anthrone → reagen anthrone → warna biru-hijau

Analisis Produk Hidrolisis Analisis kualitatif Hasil hidrolisis pati dikarakterisasi oleh nilai DE (dextrose equivalent) yang terkait dengan derajat hidrolisis DE (Dextrose Equivalent) merupakan persentase dari ikatan glikosidik yang telah terhidrolisis

Analisis Produk Hidrolisis 1.Metode Somogyi-Nelson Larutan uji dipipet ke dalam tabung reaksi sebanyak 1 ml dan ditambahkan 1 ml reagensia alkalis → dimasukkan dalam air mendidih, tepat 20 menit diangkat dan dimasukkan dalam air dingin. Kemudian ditambahkan 1 ml reagen warna arsennomolibdat, diaduk sampai homogen, dan ditambahkan 7 ml air distilasi. Serapan cahaya dibaca pada panjang gelombang 510 atau 660 nm

Analisis Produk Hidrolisis 2.Metode dengan HPLC Konsentrasi glukosa, maltosa, dan oligosakarida diukur dengan Krauer HPLC yang menggunakan kolom metacarb 67C, detektor RI 2000, fasa bergerak air, laju alir 0,5 ml/menit, temperatur 90oC, dan tekanan 725 psig. Derajat brix larutan diukur dengan refraktometer 3.Metode Osmometri metode yang akurat untuk mengukur nilai DE → mengukur penurunan titik beku larutan (sifat koligatif) → molalitas → Mr rata-rata

Analisis Produk Hidrolisis 4.Titrasi Konvensional (Lane-Eynon) Larutan uji di tambahkan reagen Fehling A dan B kemudian dipanaskan → dititrasi dalam keadaan panas dengan larutan glukosa standar yang sudah diketahui konsentrasinya Keuntungan: mudah dilakukan di laboratorium, alat-bahan mudah didapat dan sederhana, biaya analisis murah, metode sederhana dan mudah dilakukan, dapat dilakukan untuk pengambilan banyak sampel. Kelemahan: keakuratan kurang

Pengaruh Parameter Hidrolisis Konsentrasi Substrat Konsentrasi Enzim Jenis Enzim Temperatur Operasi Penambahan Ion Kalsium pH Larutan Kecepatan Pengaduk Keberadaan Komponen Minor

Konsentrasi Substrat Saat konsentarsi substrat ↑ maka konsentrasi glukosa (g/l) akan semakin ↑ Saat konsentrasi substrat ↑ maka peluang enzim untuk melakukan kontak dengan molekul substrat membentuk kompleks substrat enzim makin ↑ Dalam praktek, viskositas larutan makin ↑ saat konsentrasi substrat awal meningkat ↑ sehingga glukoamilase tidak akan berfungsi secara efektif

Konsentrasi Substrat Konsentrasi substrat pati yang tinggi akan memberikan efek kestabilan pada enzim, namun dapat menyebabkan proses gelatinisasi tidak sempurna dan timbul permasalahan pada proses filtrasi Konsentrasi substrat 30-35% memberikan kestabilan enzim yang cukup dan membuat proses gelatinisasi berlangsung sempurna

Konsentrasi Enzim Konsentrasi enzim rendah → tahap likuifaksi tidak berlangsung sempurna dan menyebabkan reaksi positif pati setelah proses dekstrinasi Konsentrasi enzim tinggi → nilai DE melebihi dari yang kita inginkan dan mahal Jumlah enzim α-amilase yang sering digunakan 0,6-1,0 liter/ton pati kering Jumlah enzim glukoamilase yang sering digunakan 0,5 -1,1 liter/ton pati kering

Jenis Enzim Kinetika reaksi dipengaruhi oleh spesifitas enzim Pemilihan enzim yang tepat memberikan hasil yang baik α-amilase dari Bacilus licheniformis atau Bacilus stearothermophillus memberikan keunggulan: jenis enzim termostabil, memberikan efisiensi pemutusan ikatan α-1,4-glikosidik yang lebih besar, dan pH proses menjadi lebih rendah (5,8-6,2) → pH yang lebih rendah akan mengurangi pembentukan produk ikutan dan pembentukan warna

Pengaruh Pemakaian Enzim

Temperatur dan pH Operasi Setiap jenis enzim mempunyai rentang temperatur dan pH optimum α-amilase (Termamyl)→ pH 6,0-7,0 & 90-105oC Glukoamilase (AMG)→ pH 4,5-5,0 & 55-60oC Temperatur tidak hanya mempengaruhi kinerja enzim namun juga mempengaruhi proses hidrolisis pati secara keseluruhan

Penambahan Ion Kalsium Ion kalsium mempengaruhi kestabilan enzim α-amilase Setiap enzim dari spesies bakteri tertentu membutuhkan ion kalsium dalam jumlah yang berbeda-beda Proses hidrolisis berlangsung dengan baik bila penambahan ion kalsium diperhatikan

Kecepatan Pengaduk Proses pengadukan mempengaruhi keberhasilan hidrolisis pati Bila pengaduk tidak berfungsi dengan baik maka ada kemungkinan proses hidrolisis gagal sebab pati akan membentuk gumpalan yang sulit dihidrolisis oleh enzim Sehingga kecepatan pengaduk harus diusahakan konstan pada kecepatan tertentu yang tidak mengakibatkan pati menggumpal

Keberadaan Komponen Minor α-amilase menunjukkan afinitas lebih tinggi untuk substrat yang mengandung jumlah protein lebih tinggi. Sebaliknya, penyisihan protein menghasilkan aktivitas enzim glukoamilase lebih tinggi Protein berfungsi sebagai mediator hidrolisis pati, bergantung pada tipe enzimnya Selama proses keberadaan protein, lemak, dan hemiselulosa menyebabkan proses flokulasi dan sulit untuk dihilangkan sehingga mengganggu tahapan proses selanjutnya

SEKIAN Terima Kasih