PERUBAHAN ASAM AMINO GLN MENJADI LEU PADA KODON rpoB513 Mycobacterium tuberculosis L1 RESISTEN RIFAMPIN Puti Syahrani (20505015) Pembimbing: A. Saifuddin Noer, Ph.D

Materi Presentasi Pendahuluan Tinjauan Pustaka Metodologi Penelitian Hasil dan Pembahasan Kesimpulan Sebelumnya, kita lihat bersama menu presentasi saya

Mycobacterium tuberculosis Penderita Tuberkulosis Pendahuluan Latar Belakang Mycobacterium tuberculosis Data WHO 2006: Menginfeksi 1/3 populasi dunia 8 juta kasus TB aktif/tahun Tingkat kematian 2 juta orang/tahun Indonesia : Peringkat ketiga, tingkat kematian 140.000 orang/tahun Jawa Barat peringkat keempat Penderita Tuberkulosis RESISTEN !! Antibiotik Jawa Barat peringkat keempat setelah Sulut, Gorontalo, DI Jkt

Resistensi M. tuberculosis Pendahuluan Resistensi M. tuberculosis SINGLE MDR XDR Resisten Rifampin & Isoniazid rpoB –  RIFR (Telenti, et al., , 1993; Musser, 1995; Ramaswamy, 1998) katG –  INHR (Musser, 1995; Ramaswamy, 1998) Mutasi paling umum dan persentasenya % No Kodon 42% Ser  Leu 43% 531 23% His  Tyr 36% 526 Mutasi pada gen rpoB Mutasi gen rpoB (pengkode RNA polimerase subunit ) Daerah penentu sifat resistensi RIF, 81 pb, kodon 507-533 Dideteksi dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) multipleks spesifik alel Mutasi pd gen yang mengkode target antibiotik atau yg berperan dlm interaksi antibiotik dgn targetnya

Pendahuluan Tujuan Penelitian Menentukan penyebab resistensi RIF pada isolat klinis M. tuberculosis MDR selain mutasi pada rpoB526 dan rpoB531 Isolat klinis M. tuberculosis MDR, katG- tetapi rpoB+ (tidak termutasi pada kodon rpoB526 dan rpoB531) (Noviana, 2006) Strategi: Amplifikasi Polymerase Chain Reaction (PCR) multipleks Sekuensing fragmen hasil PCR Analisis in silico

RNA Polimerase - Rifampin Tinjauan Pustaka RNA Polimerase - Rifampin RNA polimerase (RNAP) berperan pada proses transkripsi, terdiri atas subunit a, b, b’, s Target rifampin (RIF), obat anti- TB lini pertama RIF berikatan dengan RNAP subunit  pada kantung pengikatan RIF RIF menghambat proses transkripsi dengan menghalangi jalur perpanjangan RNA (Campbell, et al.2001) Interaksi RNAP Taq – RIF (Campbell, et al., 2001) Rifampin

Polymerase Chain Reaction (PCR) Multipleks Tinjauan Pustaka Polymerase Chain Reaction (PCR) Multipleks Fragmen AC Primer forward Primer reverse Primer dalam A B C Fragmen BC Menggunakan sepasang primer luar (forward dan reverse), ditambah primer dalam Mengamplifikasi sekaligus dua atau lebih fragmen target Dapat digunakan untuk mendeteksi mutasi pada posisi- posisi tertentu

Metodologi Penelitian Analisis in silico: Penjajaran (alignment) SeqMan dan MegAlign DNA Star Pemodelan PyMOL Sekuensing: Macrogen Inc., Korea 3730xl DNA analyzer Salah satu primer Fragmen 249 pb PCR Multipleks: rpoB526 dan rpoB531 Isolat L1, L16, R4, R7 Visualisasi gel agarosa 1,5% PCR Multipleks Sekuensing Analisis in silico

Hasil PCR Multipleks rpoB526 Hasil & Pembahasan Hasil PCR Multipleks rpoB526 M C- L1 C+ L16 R4 R7 249 pb 181 pb 249 pb RR RF R526 CAC 526 1419 pb 517 pb 396 pb 214 pb 75 pb 181 pb Ujung 3’ primer dalam komplemen dengan basa kedua kodon 526. M : pUC19/HinfI C+ : Kontrol + (M. tbc H37Rv)

Hasil PCR Multipleks rpoB531 Hasil & Pembahasan Hasil PCR Multipleks rpoB531 M C- L1 C+ L16 R4 R7 249 pb 167 pb 249 pb RR RF R531 531 TCG 1419 pb 517 pb 396 pb 214 pb 75 pb 167 pb Ujung 3’ primer dalam komplemen dengan basa kedua kodon 531. M : pUC19/HinfI C+ : Kontrol + (M. tbc H37Rv)

Rangkuman Hasil PCR Multipleks Hasil & Pembahasan Rangkuman Hasil PCR Multipleks Isolat 249 pb 181 pb rpoB526 L1  + L16 R4 R7 Isolat 249 pb 167 pb rpoB531 L1  + L16 x - R4 R7 Hanya isolat M. tbc MDR L1 yang tidak termutasi pada rpoB526 dan rpoB531  Sekuensing

Penjajaran SeqMan DNA Star Hasil & Pembahasan Penjajaran MegAlign : Mutasi A (adenin)  T (timin) pada basa kedua kodon rpoB513 (CAA  CTA) menyebabkan Gln (Q)  Leu (L)

Mutasi rpoB513 Glutamin (Gln, Q) (Polar/hidrofil, tidak bermuatan) Hasil & Pembahasan Mutasi rpoB513 Glutamin (Gln, Q) (Polar/hidrofil, tidak bermuatan) Wild type (H37Rv) translasi mutasi Leusin (Leu, L) (Non polar/ hidrofob, alifatik) Isolat L1 translasi

Pemodelan dengan PyMOL Hasil & Pembahasan Interaksi RIF-RNAP O2 Gln  Leu menyebabkan hilangnya ikatan hidrogen dengan RIF Mengganggu interaksi RIF-RNAP & aktivitas inhibisi RIF Dapat menyebabkan resistensi RIF O2 Ne2 Pemodelan dengan PyMOL

Kesimpulan Sifat resistensi RIF pada isolat klinis M. tuberculosis MDR L1 disebabkan adanya mutasi A  T pada basa kedua kodon rpoB513, yang menyebabkan perubahan asam amino Gln  Leu. Perubahan ini dapat mengganggu interaksi RIF-RNAP sehingga RIF tidak dapat menginhibisi RNAP dan M. tuberculosis menjadi resisten RIF.

SEKIAN TERIMAKASIH

PCR Multipleks Siklus PCR : R526 GTCGGGGTTGACCCA 15 nt R531 Metodologi Penelitian PCR Multipleks Siklus PCR : Denaturasi awal: 96°C, 3 menit 5 siklus: 95°C, 45 detik - 60°C, 1 menit - 72°C, 30 detik 5 siklus: 95°C, 40 detik - 59°C, 50 detik - 72°C, 30 detik 22 siklus: 94°C, 50 detik - 55°C, 40 detik - 70°C, 30 detik Elongasi akhir pada 72°C selama 3 menit Primer dalam Urutan 5’  3’ Ukuran R526 GTCGGGGTTGACCCA 15 nt R531 ACAAGCGCCGACTGTC 16 nt

Inhibisi RIF terhadap RNAP Tinjauan Pustaka Inhibisi RIF terhadap RNAP (Campbell, et al., 2001) Menjadi halangan sterik pada jalur perpanjangan RNA pada ujung 5’, ketika panjang transkrip 2-3 nukleotida

Daerah resistensi RIF pada RNAP subunit b Tinjauan Pustaka Daerah resistensi RIF pada RNAP subunit b Daerah resistensi RIF pada rpoB prokariot (E. coli, Taq, M. tbc) (Campbell, et al., 2001)