Seminar Tugas Akhir II : Rabu, 26 Mei 2010 Pengaruh Daerah b’x Protein Disulfida Isomerase (PDI) Ragi dalam Pemnbuatan Roti Seminar Tugas Akhir II : Rabu, 26 Mei 2010 DITA AYU PRATIWI (10506054) PROGRAM STUDI KIMIA INSTITUT TEKNOLODI BANDUNG 2010

AGENDA PRESENTASI Latar Belakang Tinjauan Pustaka Tujuan Metodologi Penelitian Hasil Penelitian Kesimpulan dan saran

LATAR BELAKANG Bread Improver Sodium karbonat Garam fosfat Asam Askorbat Enzim : Amilase,Protease

Protein Disulfida Isomerase (PDI, E.C. 5.3.4.1) TINJAUAN PUSTAKA Protein Disulfida Isomerase (PDI, E.C. 5.3.4.1) Reduksi,Oksidasi, isomerase ikatan disulfida S-S , S-H Diisolasi pertama kali oleh Cristian Anfinsen (1963) Aktivitas chaperon

TINJAUAN PUSTAKA Protein Disulfida Isomerase (PDI, E.C. 5.3.4.1) 5 domain : a dan a’ : sisi aktif b dan b’: sisi pengikatan substrat/ residu asam amino c : sisi retensi pada rektikulum endoplasma Linker x : kekompakan struktur PDI

TINJAUAN PUSTAKA PDI-∆b’x (MUTAN) Mutasi : delesi fragment Nukleotida 246-382 Tidak ada domain b’ dan linker x Perubahan fungsi dan struktur protein

Tepung Gandum (bahan dasar pembuatan roti) TINJAUAN PUSTAKA Tepung Gandum (bahan dasar pembuatan roti) 80% protein gluten Gluten : campuran amorf protein Terdiri atas : gliadin dan glutenin Kaya residu Sistein

TUJUAN Mengetahui pengaruh delesi daerah b’x pada Protein Disulfida Isomerase (PDI1-∆b’x) sebagai bread improver pada pembuatan roti.

METODOLOGI PENELITIAN Transformasi E.coli Ekspresi Protein Pemurnian Protein Analisis Protein Pembuatan roti Uji Aktivitas Protein Uji Kadar Protein

METODOLOGI PENELITIAN Transformasi E.coli Plasmid pT 7.7 PDI1-∆b’x E.Coli BL21 Medium LB+ Ampisilin Peremajaan E. coli BL-21 Pembuatan Sel kompeten Transformasi E. coli BL-21 (Mutan dan Wildtype) Ekspresi Mutan pdiI-∆b‘x dan wild type Pemurnian Mutan pdiI-∆b‘x dan wild type SDS Page : Analisis Mutan pdiI-∆b‘x dan wild type Uji aktivitas Mutan pdiI-∆b‘x dan wild type Penentuan kadar Protein (bradford) Pembuatan Roti

E.coli Transforman dalam Medium Luria Bertani slide HASIL E.coli Transforman dalam Medium Luria Bertani slide KONTROL (+): Medium LB KONTROL (-) : Medium LBa MUTAN : Medium LBa WILD TYPE : Medium LBa

METODOLOGI PENELITIAN Transformasi E.coli Ekspresi Protein Pemurnian Protein Analisis Protein Pembuatan roti Uji Aktivitas Protein Uji Aktivitas Protein

Ekspresi Protein Mutan dan Wildtype METODOLOGI PENELITIAN Ekspresi Protein Mutan dan Wildtype Koloni tunggal E.coli Starter (overnight culture) Kultur 200 mL LB Induksi IPTG Lisis Sel E.coli (lisozim, Sonikasi) Ekstrak Kasar Protein Peremajaan E. coli BL-21 Pembuatan Sel kompeten Transformasi E. coli BL-21 (Mutan dan Wildtype) Ekspresi Mutan pdiI-∆b‘x dan wild type Pemurnian Mutan pdiI-∆b‘x dan wild type SDS Page : Analisis Mutan pdiI-∆b‘x dan wild type Uji aktivitas Mutan pdiI-∆b‘x dan wild type Penentuan kadar Protein (bradford) Pembuatan Roti

METODOLOGI PENELITIAN Transformasi E.coli Ekspresi Protein Pemurnian Protein Analisis Protein Pembuatan roti Uji Aktivitas Protein Uji Aktivitas Protein

Pemurnian Protein fraksinasi (NH4)2SO4 METODOLOGI PENELITIAN Pemurnian Protein fraksinasi (NH4)2SO4 Fraksinasi (NH4)2SO4 (Pengendapan Protein) Dialisis (Penghilangan ion sulfat dalam larutan protein) FRAKSINASI + NH2SO4 0-70% Sentrifuga Pelet protein (+buffer) dIALISIS Peremajaan E. coli BL-21 Pembuatan Sel kompeten Transformasi E. coli BL-21 (Mutan dan Wildtype) Ekspresi Mutan pdiI-∆b‘x dan wild type Pemurnian Mutan pdiI-∆b‘x dan wild type SDS Page : Analisis Mutan pdiI-∆b‘x dan wild type Uji aktivitas Mutan pdiI-∆b‘x dan wild type Penentuan kadar Protein (bradford) Pembuatan Roti Enzim dalam membran Dicelupkan buffer 5X Ion sulfat hilang (uji BaSO4)

METODOLOGI PENELITIAN Protein + buffer concentrated dalam membran selofan

METODOLOGI PENELITIAN Transformasi E.coli Ekspresi Protein Pemurnian Protein Analisis Protein Pembuatan roti Uji Aktivitas Protein Uji Kadar Protein

Analisis Protein : SDS Page METODOLOGI PENELITIAN Analisis Protein : SDS Page Sodium Dodecyl Sulfate polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS Page): Pemisahan berdasarkan Ukuran Protein (kD) Persiapan Sampel Persiapan Stacking dan separating gel Elektroforesis Staining dan destaining

Analisis Protein : SDS Page METODOLOGI PENELITIAN Analisis Protein : SDS Page 1 2 3

Protein + laoding bufer dalam sumur METODOLOGI PENELITIAN Protein + laoding bufer dalam sumur

Elektroforesis: Mobilitas Protein berdasarkan ukuran HASIL Elektroforesis: Mobilitas Protein berdasarkan ukuran 97 66 45 30 20 14,4 kDa Lajur 1 : Marker Lajur 2 : Wild Type crude protein Lajur 3 : Fraksi 0-30% Wild Type protein Lajur 4: Fraksi 30-70% Wild Type protein Lajur 5 : Mutan crude protein Lajur 6 : Fraksi 0-30% Mutan protein Lajur 7 : Fraksi 30-70% Mutan protein 1 2 3 4 5 6 7

METODOLOGI PENELITIAN Transformasi E.coli Ekspresi Protein Pemurnian Protein Analisis Protein Pembuatan roti Uji Aktivitas Protein Uji Aktivitas Protein

Uji Aktivitas Protein : Substrat Insulin METODOLOGI PENELITIAN Uji Aktivitas Protein : Substrat Insulin Kemampuan enzim PDI dalam Mereduksi Ikatan Disulfida Insulin Jumlah ikatan disulfida yang tereduksi sebanding dengan Absorbansi larutan pada λ 650 nm Spektrofotometer Sinar tampak KUVET: +Buffer fosfat+Insulin, +EDTA+ Protein Spektrofotometer UV-VIS λ 650 nm

Kurva aktivitas mutan dalam mereduksi ikatan disulfida Insulin HASIL Kurva aktivitas mutan dalam mereduksi ikatan disulfida Insulin A t

Kurva aktivitas wildtype dalam mereduksi ikatan disulfida Insulin HASIL Kurva aktivitas wildtype dalam mereduksi ikatan disulfida Insulin A t

HASIL Perbandingan aktivitas mutan dan wildtype dalam mereduksi ikatan disulfida Insulin A t

HASIL Fraksi Mutan Kadar Protein Total (mg/mL) Aktivitas (Unit/mL) Aktivitas Spesifik (Unit/mg) Crude protein 5.55 1840 331.53 Fraksi 0-30% 1.46 1660 1136.99 Fraksi 30-70% 4.15 2640 636.14 Fraksi WildType 5.97 2380 398.66 1.09 1740 1596.33 3.57 3480 974.79

METODOLOGI PENELITIAN Transformasi E.coli Ekspresi Protein Pemurnian Protein Pembuatan roti Analisis Protein Uji Aktivitas Protein Uji Kadar Protein

METODOLOGI PENELITIAN Pembuatan Roti : 1. Kontrol (bahan dasar standar) 2. Kontrol +GSH : GSSG (3:1) ( sebagai Bufer redoks enzim) 3. Kontrol +GSH : GSSG (3:1) +enzim PDI1 (34,11 unit/gram) (Wildtype) 4. Kontrol +GSH : GSSG (3:1) +enzim PDI1-Δb’x (47,89unit/gram) (Mutan) Fermentasi 2 jam Diuleni (proses kneading) Inkubasi suhu ruang 2 jam Panggang 180◦C, 45 menit Bahan Kering (terigu, garam, ragi) Larutan (air, enzim, buffer redoks Adonan

METODOLOGI PENELITIAN Pembuatan Roti Sebelum fermentasi 4 3 2 1 2 1 3 4 Setelah fermentasi

HASIL 3 4 1 2

Perhitungan volume roti : metode pendesakan biji sawi (Archimides) HASIL Perhitungan volume roti : metode pendesakan biji sawi (Archimides) Sampel roti VOLUME (mL) BERAT (gram) VOLUME JENIS (mL/gram) KONTROL 174.00 ± 0.84 124.97± 0.25 1.390 ± 0.01 GSH: GSSG 196.00 ± 1.55 138.76± 0.28 1.412 ± 0.01 WILDTYPE 218.80 ± 1.20 152.90 ± 0.15 1.431 ± 0.01 MUTAN 194.60 ± 0.98 137.42± 0.30 1.416 ± 0.00

HASIL tekstur pori wildtype kontrol Mutan GSH : GSSG

KESIMPULAN Delesi daerah b’x Protein Disulfida isomerase memiliki pengaruh terhadap volume dan tekstur pori roti yakni: Enzim Ukuran (kilo Dalton) Aktivitas Spesifik (Unit/gram) Volume jenis Roti (mL/gram) Tekstur roti PDI1-Δb’x (Mutan) 45 1136.99 1.416 ± 0.00 kecil PDI1 (wildtype) 66 1596.33 1.431 ± 0.01 besar

SARAN Jumlah unit aktivitas enzim yang ditambahkan dalam adonan di lakukan bervariasi

Ucapan Terimakasih: Drs. Dessy Natalia Drs. Zeilly N Teman-teman lab Biokimia lt.1&3 : Radi, Sofi, Tita, Mas fean, Teh Ogi, Teh popi, Teh Sari, bu Fe, ka edu, ka edo, teh wawi, icha, ichu, Ricky, anita, monita, anin,merry, eva, hida, ka sol, mba kelly, mba ivon, ka hendrik dan kaka-kaka S2 dan S3 lainnya. Teman-teman peserta seminar (kimia dan non kimia)

Terimakasih