Rekayasa Enzim dan Metagenom

Keanekaragaman Protein Keanekaragaman hayati Rekayasa Protein

Pembuatan Mutan Directed Random Recombination

Rational Protein Design Perubahan asam amino/urutan spesifik Ideal: perubahan sifat yang dapat diprediksi Memerlukan informasi struktur protein dan ‘intuisi’

Efficient & Rational Protein Design Interdisiplin Gen berada dalam vektor ekspresi yang baik Struktur 3-D protein Computer modelling Struktur 3-D protein homolog, jika tidak ada informasi struktur Informasi struktur-fungsi dari protein homolog/related

Directed rational (site directed mutagenesis) G TAC GGC CCG TAA A C CGC ATC TTT AAA AAA AAT ATG CCC GGC ATT TTG GCG TAG AAA TTT TTT TTA

Perbaikan Stabilitas Protein Penambahan ikatan disulfida: Lokasi sistein berdekatan pada struktur 3 D Bukan merupakan pusat aktif Tidak merubah struktur Mengganti asam amino yang dapat teroksidasi asparagin dan glutamin. Penambahan ikatan hidrogen, jembatan garam, interaksi hidrofobik

Varian Streptokinase WT Lys386Gln Lys59Gln Lys386Gln, Lys59Gln Mutasi menyebabkan protein menjadi tahan terhadap plasmid

Random: Error prone PCR Kesalahan pada saat polimerisasi oleh DNA polimerase Penurunan fidelitas DNA polimerase oleh ion Mn2+ Penurunan konsentrasi nukleotida Peningkatan siklus PCR Terbatas pada fragmen berukuran kecil ( <800pb)

Recombination: DNA shuffling Stemmer WP. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature 1994 370, 389-91 Pencampuran materi genetik dari induk yang berbeda DNA induk dipotong dengan DNaseI Fragmen acak mengalami proses denaturasi, annealing, dan perpanjangan yang dikatalisis oleh DNA polimerase

Recombination Family shuffling Extention of technique to homologous genes Need >60% similarity 1. Fragment 2. Reassemble

DNA Shuffling

Recombination DNA shuffling Wt gene Error prone PCR or other method DNase I fragmentation

α-Amylase Bacillus amyloliquefaciens Temperatur optimum 50oC-70oC pH optimum 6 Likuifasi pati dan detergen Site directed mutagenesis: BAA S201N (pada pH 10 aktivitas meningkat 16%; pada pH 10 aktivitas meningkat 50%) dan BAA N297D (pada pH 10 aktivitas sama dengan WT; pada pH 11 aktivitas meningkat 50%) Error prone PCR: 7200 klon – 16 mutant DNA shuffling: 10.000 klon: 960 klon positif berdasarkan uji staining. Penapisan ulang: BAA42 (pH optimum 7, aktif pada daerah pH yang lebih luas, aktivitas meningkat 5 x pada pH 10) dan BAA 29 (profil pH sama dengan WT, aktivitas spesifik meningkat 9 x)

Lili Euwilaichtr