Kromatografi Cair Kinerja Tinggi High Performance Liquid Chromatography Oleh: Purwadi, M.Si. Universitas Tulang Bawang, Bandar Lampung, 2009

Color Sistem pemasukan sampel: manual, tidak volumetrik  Injector Kromatografi Kolom Terbuka Sistem pemasukan sampel: manual, tidak volumetrik  Injector Waktu analisis lama, mengandalkan gaya grafitasi dan kapiler  pompa Hasil pemisahan kurang baik  pengemasan kolom Kesulitan Pengamatan hasil pemisahan untuk analit tidak berwarna  Detektor Kesulitan penghitungan kadar  integrator Color

KCKT dikembangkan dari kromatografi kolom terbuka untuk menjawab kekurang-kekurangan tersebut Injector: Sistem pemasukan sampel: sample loop dan robotik injektor, sangat volumetrik Pompa: Waktu analisis singkat, pengulangan/presisi baik Kolom: baja, packing kompak, partikel sangat kecil, tekanan dapat dibuat besar  Hasil pemisahan baik Detektor: semua zat dapat diamati (tidak harus berwarna) Integrator:dilengkapi komputer, bisa menghitung AuC  mudah penghitungan kadar  Sehingga disebut: Kinerja Tinggi

BAGAN SISTEM KCKT detektor kolom injektor oven integrator pompa Wadah solven integrator

WADAH FASE GERAK Merupakan tandon berisi fase gerak Mempunyai sistem penyaring

POMPA Merupakan sistem agar fase gerak mengalir. Kinerja pompa yang diinginkan : Tekanan yang dihasilkan tinggi Fluktuasi tekanan rendah Kecepatan aliran fase gerak tepat

INJEKTOR: Alat untuk pemasukan sampel ke dalam sistem KCKT Pump Pump Column Column [INJECT] [LOAD]

Sistem sample loop injektor posisi load Posisi inject pompa kolom kolom pompa sample loop

OVEN KOLOM – instrumen pemanas Syarat : Keseragaman temperatur yang baik Kestabilan temperatur yang baik Ketepatan kontrol temperatur yang baik

Kolom pada KCKT > Penampang: baja tahan karat, tahan tekanan tinggi Ukuran partikel sangat kecil: pengepakan lebih kompak, hasil pemisahan lebih baik Dapat dipakai berulang

DETEKTOR HPLC Yang umum dipakai Detektor Ultraviolet / Visible (UV/VIS) Detektor Photodiode Array (PDA) Detektor Fluorescence (RF) Detektor Konduktivitas (CDD) Detektor Refraktive Indeks (RID) Detektor Elektrokimia (ECD) Detektor spektrometer massa

Hk.Lambert-Beer Ein Eout A= eCl = - log (Eout / Ein) DETEKTOR SPEKTROFOTOMETER UV/VIS Prinsip: penyerapan sebagian energi (hv) oleh molekul pada panjang gelombang tertentu => tereksitasi elektronik Eksitasi elektronik kuvet Ein Eout l Hk.Lambert-Beer A= eCl = - log (Eout / Ein)

A= eCl = - log (Eout / Ein) absorbansi Kisaran linear 1 konsentrasi

Pemilihan pjg gelb.: quantitative / preparative? 275 nm 208 nm

Detektor Photodiode Array Sample Cell Grating satu elemen dapat Mendeteksi absorban Pada satu pjg gelb.. D2 / W lamp 512 Elements Photodiode Array

Detektor Photodiode Array : Kromatogram 3D Spektrum kromatogram Absorbansi Panjang gelb. waktu

Detektor Photodiode Array Puncak dapat di identifikasi dengan spektrum UV. Pemeriksaan kemurnian puncak dapat dilakukan. --overlap 3 spektrum --rasio kromatogram --perbandingan threshold dan similarity index.

* * Detektor Spektrofluoresen + hn1 hn2+ A* hn2 Fluorescence A A hn1 Excitation Wavelength * + hn1 * hn2+ A* Emission Wavelength hn2 hn1 Fluorescence A A

Rancangan Cell untuk detektor Fluorescence

Reagen derivatisasi Reagen OPA untuk amine primer A + R-NH2 N-R CHO o-phthalaldhyde (OPA) + R-NH2 N-R A Reagen ADAM untuk asam lemak + R-COOH CHN2 CH2OCOR 9-anthryldiazomethane (ADAM)

Detektor Refraktive Indeks Sistem optik

Detektor Refraktive Indeks

BAGIAN DARI SISTEM HPLC Kromatogram gula Analytical Conditions Column : Shim-pack CLC-NH2 Mobile phase : Acetonitrile / water = 7 / 3 Flow rate : 1.0 mL/min Temperature : Ambient Peaks 1. Glycerol 2. Xylose 3. Fructose 4. Glucose 5. Sucrose 6. Manose 7. Lactose

Detektor Konduktifitas K (conductivity) = I [A] / E [V] =A [cm2] / L [cm] * k (k : specific conductivity) k= (I/E)*(L/A) V I A A L elektroda

Detektor Konduktifitas Konduktifitas sangat dipengaruhi temperatur. Cell harus diletakkan pada kondisi temperatur terkontrol

Kromatogram anion dalam air laut Analytical Conditions Column : Shim-pack IC-A3 Mobile phase : 8.0 mM p-hydroxybenzoic acid 3.2 mM Bis-Tris * Flow rate : 1.5 mL/min Temperature : 40 C Injection Volume : 100 uL Peaks 1. F (1.4 ppm) 2. Cl (10200 ppm) 3. NO2 (10 ppm) 4. Br (43 ppm) 5. NO3 (44 ppm) 6. SO4 (431 ppm) Bis-Tris : bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane

Perbandingan detektor LOD : Limit deteksi (S/N=3) GC : Gradient Compatibility