Isolasi Gen α-Amilase B. aquimaris MKSC 6 Isolasi Gen α-Amilase B. aquimaris MKSC 6.2 dengan Teknik Degenerate PCR dan Inverse PCR Fernita Puspasari

α-Amilase Hidrolisis ikatan -1,4 glikosidik polisakarida Protein multidomain Aplikasi: makanan, detergen, kertas, tekstil, bioetanol -1,4-glikosidik -1,6-glikosidik dekstrin oligosakarida linier glukosa maltosa amilopektin amilosa α-Amilase. α-Amilase adalah suatu endoenzim yang bekerja mengkatalisis reaksi hidolisis ikatan -1,4 glikosidik suatu polisakarida. α-Amilase merupakan suatu protein multidomain. Paling tidak suatu α-amilase memiliki tiga domain utama, yang disebut domain A, B, dan domain C. Domain A yang berwarna hijau ini adalah domain katalitik α-amilase. Sampai saat ini belum ada publikasi baik struktur maupun karakter α-amilase Bacillus sp. yang berasosiasi dengan koral lunak Sinularia sp.

α-amilase termostabil Industri Pengolahan Pati 105 oC 50-60 oC Suspensi pati gelatinisasi likuefaksi sakarifikasi α-amilase termostabil glukoamilase Hidrolisis pati: gelatinisasi suhu ↑, biaya ↑ -Amilase pendegradasi pati mentah: biaya ↓, menyederhanakan proses konversi pati.

Bacillus aquimaris MKSC 6.2 Bakteri laut, berasosiasi dengan koral lunak Sinularia sp.  perairan P. Merak Kecil Sampel Di laboratorium biokimia kita, kelompok Ibu Dessy mempunyai cukup banyak koleksi bakteri laut, sebagian besar memiliki aktivitas amilase. Dari sekian banyak koleksi yang kami miliki, hanya sedikit yang dapat mendegradasi butir pati, salah satunya adalah bakteri yang setelah diidentifikasi dengan metoda sekuensing gen 16S r RNA merupakan B. aquimaris. Butir pati jagung yang semula mulus, setelah perlakuan dengan supernatan kultur B. aquimaris menjadi berlubang-lubang. Struktur permukaan ini dilihat dengan SEM Identifikasi bakteri: penjajaran urutan nukleotida gen 16S rRNA

Kemampuan mendegradasi pati mentah 1 hari 2 hari 1 2 1: Bacillus aquimaris MKSC 6.2 2: bakteri yang tidak mampu mendegradasi pati mentah Media: marine agar plate+1% pati kentang mentah+KI/I2 5

Scanning Electron Microscopy jagung singkong sagu kentang beras

? Belum ada informasi genom B. aquimaris Bagaimana mengisolasi gen α-amilase B. aquimaris ? Konstruksi perpustakaan genom (genomic library) PCR 7

Konstruksi Koleksi Genom Parsial

potong potong DNA vektor DNA genom Enzim restriksi Enzim restriksi ligasi Transformasi E.coli Uji aktivitas Hibridisasi DNA Hibridisasi protein Penapisan .

Koleksi Genom Parsial B. aquimaris Pemotongan dengan EcoR I 23.130 pb 9.416 pb 6.557 pb 4.361 pb 2.322 pb 2.027 pb λ/Hind III genom B. aquimaris/EcoR I plasmid sisipan Diperoleh 5000 koloni transforman Masalah: penapisan  false positive 10

Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

Analisis in silico ±800 bp No Clone 5’-end 3’-end 1. 66(4) Ribosomal protein (S18)-alaninine acetyltransferase (Bacillus sp. SG-1), 65% identity Peptidase M22 glycoprotease (B. weihenstephanensis), 62% identity 2. 36(7) Aspartate aminotransferase (Bacillus sp. SG-1), 68% identity. ATP-dependent DNA helicase/ DNA pol. III subunit ε (Bacillus sp. SG-1), 69% identity 3. 59(10) ATP-dependent DNA helicase (Bacillus sp. SG-1), 68% identity Glycrone-kinase protein (Bacillus sp. SG-1), 72% identity 4. 10(7) N-acetylmuromoyl-L-alanine amidase (B. coahuilensis), 40% identity Polysaccharide biosynthesis protein (Pelobacter carbinolicus), 42% identity 5. 45(13) Epidermal surface antigen (Bacillus sp. SG-1), 91% identity Epidermal surface antigen (Bacillus sp. SG-1), 74% identity

Degenerate PCR

Komponen PCR Templat DNA polimerase Bufer DNA polimerase dNTP Primer forward (degenerate) Primer reverse (degenerate) forward reverse

Degenerate Primer >< specific primer Campuran primer yang mirip Dirancang dari urutan asam amino yang telah diketahui atau hasil penjajaran gen yang sama dari beberapa organisme lain yang telah diketahui

Empat Daerah Lestari Keluarga -Amilase C B 16

B. coahulensis Bacillus sp. SG-1 B. weihestephanensis B. coahuilensis

B. weihestephanensis B. coahuilensis Bacillus sp. SG-1 B. licheniformis B. subtilis

Daerah Lestari berbagai Bacillus Ac. No. Organisme I II IV V ZP_03225714 B. coahuilensis MKVILDFVVNHVG IDGYRLDTVRHV FIDNHD PIVYYGSEIALNG ZP_01861961.1 Bacillus sp. SG-1 MKIVLDFIVNHVG PILYYGSEIALSG YP_001646639 B. weihenstephanensis IKVMLDAVFNHSG IDGWRLDVANEV LLDSHD PCIYYGDEIGMDG ZP_03225711 LIGSHD PCIYYGDEIGLTG

Rancangan Primer Primer Region Urutan nt ambg Tm F1 I GAYTTYRTYGTSAATCAYGTYGG 23 7 55.64 60 F2 II GAYGGRTAYCGTCTRGATACYG 22 5 58,95 62 R1 CRGTATCYAGACGRTAYCCRTC R2 IV AATCGWMYCATATCATGGTTATC 3 55,64 R3 V CGYTTAAAGCAATTTCWGATCC 2 57,08 R4 CAGATCCRTAGTAAASAATSGG 56.22

Perancangan Degenerate Primer Panjang: ~20 (18-24) Ujung 3’: G/C 3 basa di ujung 5’ dan 3’ tidak boleh komplemen %GC: 40-60, Tm: ~60oC Ujung 3’: hindari degenerate, dipillih basa yang pasti

Pengaruh jumlah primer Variasi jumlah primer Primer yang diperlukan pada degenerate PCR jauh lebih banyak daripada PCR biasa (5-10X) Normal: 20 pmol/50 μL reaksi Degenerate: 100-200 pmol/50 μL reaksi 4 3 2 1 x normal

Rujukan penomoran: gen α-amilase Bacillus sp. SG1 Isolasi gen α-amilase: degenerate PCR 643 658 536 238 1 1437 307-329 523-544 820-842 943-964 For 1 For 2 Rev 1 Rev 2 Rev 3 928-949 Rev 4 643 pb 307 949 320 442 427 Rujukan penomoran: gen α-amilase Bacillus sp. SG1

Inverse PCR

Komponen PCR Templat DNA polimerase Bufer DNA polimerase dNTP Primer forward (spesifik) Primer reverse (spesifik) 643 pb forward reverse

Inverse PCR Enzim restriksi kromosom Self-ligasi PCR Hasil PCR

1 523 427 949 11-30 117-136 155-160 165-184 388-407 Cla I Harus ada daerah yang telah diketahui urutannya dengan pasti: menentukan enzim restriksi, merancang primer spesifik

InvR ClaI ClaI ClaI InvF Pemotongan dengan enzim restriksi ClaI InvF InvR ClaI Self-ligasi PCR ClaI InvR InvF

Rujukan penomoran: gen α-amilase Bacillus sp. SG1 Isolasi gen α-amilase: inverse PCR 307 949 ClaI 643 pb 949 112 HindIII 838 pb 112 1437 HindIII 1326 pb -102 1437 1539 pb 1539 1 Rujukan penomoran: gen α-amilase Bacillus sp. SG1

Urutan Gen -Amilase B. aquimaris MKSC 6.2 ATGAAAAGAAGAGTACTATCTCTCATTTTAGTCCCGTTTCTTCTTTTTTACGCCCTTCCGGTAGGTGCAGTTGAAAAAGAAGAACGAAAG M K R R V L S L I L V P F L L F Y A L P V G A V E K E E R K TGGCAGGATGAAACAATTTATTTCCTAATGGTAGATCGCTTTAACAATGGTGATCCAACAAATGATAAAGAAGTGAACACAAAGGATCCC W Q D E T I Y F L M V D R F N N G D P T N D K E V N T K D P AAGGCTTACCATGGCGGTGATTTCCAAGGGGTTATCGATCGATTGGATTACATCAAAGATATGGGATTCACTTCCATATGGCTGACTCCC K A Y H G G D F Q G V I D R L D Y I K D M G F T S I W L T P GTATTTGACAACCAGCCAAAAGGATACCATGGATATTGGATTACGGACTTTTATAAGACCGACGAGCATTTCGGTACGATGGAAACGTTC V F D N Q P K G Y H G Y W I T D F Y K T D E H F G T M E T F AAAAAGCTTGTAGAAGAAGCACATAAGCGGGATATGAAAGTCGTCCTTGATTTTGTGGTTAACCATGTGGGGCCGGAGCATCCCTGGGTG K K L V E E A H K R D M K V V L D F V V N H V G P E H P W V GATGACCCTGCAAAAGAAGACTGGTTCCACGAAAAACAGCCAATGAACTTCTCCGACAAAGAAAGTCTTCAGAACGCATGGCTGTATGAC D D P A K E D W F H E K Q P M N F S D K E S L Q N A W L Y D CTTCCTGATTTAAACACAGAGAATCCCGAAGTAAGGGAATATCTCTTTGATGCTGCCAAATGGTGGATCAAAGAAACGGATGTCGACGGT L P D L N T E N P E V R E Y L F D A A K W W I K E T D V D G TATCGTCTGGACACGGTGCGCCATGTTCCACAAGATTTTTGGAGTGATTTCAGTAAAGAAGTTAAATCAGTGAAAGACGATTTTTATCTT Y R L D T V R H V P Q D F W S D F S K E V K S V K D D F Y L CTTGGTGAAGTGTTTGATCGTGACCCACAGAAGATAGCAGAATATAACGATGTGGGTATCGATGGATTCGTTAATTTCCCCCAAGCTGAA L G E V F D R D P Q K I A E Y N D V G I D G F V N F P Q A E GAATTACGTTCAGTGTTTAACAAACCTGATACTTCAATGGACAGGTTGTTCAATTTCTGGAAGTACAATGAAACATTTTATGAAGATCCT E L R S V F N K P D T S M D R L F N F W K Y N E T F Y E D P TATTTGATGGGGACTTTTATAGACAACCATGATATGGAACGTTTTACACGTTTATTGGTACAGGAAAATGTTTTCCCTGGTACCCGTTGG Y L M G T F I D N H D M E R F T R L L V Q E N V F P G T R W AAACTCGCCTTGACATATATGTACACGACTCCGGGAATACCGATTGTGTATTATGGGTCTGAAATTGCCATGGATGGCGGGGAAGACCCG K L A L T Y M Y T T P G I P I V Y Y G S E I A M D G G E D P GATAACCGGCGGTTGATGAATTTCAGGGCCGACAAAGAACTGATTGATTACATTTCAAAACTGGGCAAGGTTCGAAAGGACTATCCTGCT D N R R L M N F R A D K E L I D Y I S K L G K V R K D Y P A TTGACAAGAGGAACGATAGAGCCGTTGTATGAACAAGACGGATTGGGAATATATAAACGCGCATACAAAGATCAAACGGTGGTTGTAGCC L T R G T I E P L Y E Q D G L G I Y K R A Y K D Q T V V V A ATCAATAATTCCAGTGAGACCCAAACTGTCGAACTTGATGAAGGGGAGCTTGCTGATAACAATGAACTAAAAGGGTTACTTTCAGATGAC I N N S S E T Q T V E L D E G E L A D N N E L K G L L S D D CTGGTGAGAAGCGATGAAAACGGGACGTATAAAGTCGCTTTGGATCGTGAAGAAGCAGAGATTTATCTGCTTAAAGCCAAAAGTGGACTG L V R S D E N G T Y K V A L D R E E A E I Y L L K A K S G L AACATCCCATATTTATCAGCACTTGCTGCGGTGTATGTATTATTTTTATTATTTATTTATCTAGTATGGAAACGCGGAAGAAAAAACCGC N I P Y L S A L A A V Y V L F L L F I Y L V W K R G R K N R AAATCATAA 1539 bp K S . 512 aa