PENGENALAN SPEKTROFOTOMETER

Peralatan spektroskopi merupakan peralatan analisa deteksi atau pengenalan bahan. Spektroskopi digunakan untuk menentukan struktur dan reaksi kimia senyawa-senyawa. Keunggulannya: Tidak memerlukan perusakan bahan Berpotensi utk dikembangkan dan dijalankan secara otomatis Bahan analisa yg dibutuhkan hanya sedikit dan bahkan dalam keadaan tercampur

Spektrofotometer : suatu metode analisis yg melibatkan bagaimana sinar berinteraksi dengan atom (atau molekul) dalam suatu sampel

Sinar tampak hanya sebagian kecil dari keseluruhan spektrum elektromagnetik dan dalam sinar terdapat warna umum yang dapat diobservasi (merah, kuning, hijau, biru dan violet). Spektrum tampak terdiri dari radiasi elektromagnetik yang mempunyai panjang gelombang dari 400 nm sampai mendekati 800 nm. Warna suatu sinar berkaitan dengan masing-masing panjang gelombang yang dapat diobservasi dengan mata.. Kisaran visible suatu sinar berkisar antara 400 sampai 700 nm.

Pembagian daerah UV-visibel λ Warna yang diserap Warna yang teramati 410 430 480 500 530 560 580 610 680 720 Violet Biru-violet Biru Hijau-biru Hijau Kuning-hijau Kuning Jingga Merah Merah-ungu

Spektrum Elektromagnetik Wavelengths are commonly given in ???? Lambda λ 6

Warna & panjang gelombang COLOR WAVELENGTH (λ in nm) Ultraviolet < 380 Violet 380 – 435 Blue 436 – 480 Greenish-blue 481 – 490 Bluish-green 491 – 500 Green 501 – 560 Yellowish-green 561 – 580 Yellow 581 – 595 Orange 596 – 650 Red 651 – 780 Near Infrared > 780 Sinar tampak

Sinar putih yg dapat diobservasi, sebenarnya merupakan campuran semua warna sinar Mengapa hampir semua substansi mempunyai warna ? Apabila sinar melewati suatu substansi, energi tertentu (atau warna) diabsorbsi, sementara warna lain dapat melewati atau dipantulkan oleh substansi tersebut

Apabila suatu substansi tidak dapat mengabsorbsi sinar, substansi tersebut akan berwarna putih (semua sinar dipantulkan) atau tidak berwarna (semua sinar ditransmisi). Suatu larutan mempunyai warna tertentu karena absorbansi dan transmisi sinar nampak. Sebagai contoh , larutan berwarna biru nampak biru karena larutan tersebut mengabsorbsi semua warna kecuali warna biru.

Jumlah sinar yg diabsorbsi oleh suatu larutan tergantung pada: 1. kemampuan komponen untuk mengabsorbsi sinar (molar absorptivity), 2. jarak dimana sinar dapat melewati sampel (path length) 3. konsentrasi molar senyawa dalam larutan. Jika senyawa yg sama digunakan dan path length dipertahankan konstan, maka absorbansi akan proporsional dengan konsentrasi sampel.

Spektrofotometer didesain untuk mendeteksi absorbansi sinar pada panjang gelombang yang berbeda apabila sinar dapat melewati suatu larutan dengan konsentrasi tertentu Beberapa senyawa mengabsorbsi sinar lebih banyak pada suatu panjang gelombang tertentu daripada pada panjang gelombang lainnya, sehingga panjang gelombang harus disesuaikan setiap ganti senyawa yang akan di analisis untuk mencapai hasil yang optimum dari spektrofotometer. Panjang gelombang sinar diseleksi melalui penetapan panjang gelombang dan terlihat di display panjang gelombang. Warna suatu sinar berkaitan dengan masing-masing panjang gelombang yang dapat diobservasi dengan mata.. Kisaran visible suatu sinar berkisar antara 400 sampai 700 nm.

Spekrofotometer Spektrofotometer digunakan untuk memberikan sumber sinar dari energi tertentu (wavelength) dan untuk mengetahui jumlah sinar yang diabsorbsi oleh sampel. Light Bulb Prism Filter Slit Sample Detector

Prinsip kerja Spektrofotometer spektrofotometer meliputi sumber radiasi sinar putih yg melewati suatu monokromator. Monokromator merupakan prisma yang memisahkan sinar putih menjadi semua warna dari visible spektrum. Setelah sinar terpisah, sinar akan melalui suatu filter (untuk memblok out sinar yang tidak dinginkan, seringkali sinar dari warna yang berbeda). Selanjutnya suatu sinar melewati sampel dan bagian yang tidak terabsorbsi mengenai fotodetektor. Sinar kemudian menjadi output yang digunakan dalam analisis suatu sampel.

Absorpsi sinar Sinar putih Semua warna Sinar Polychromatic When white (polychromatic) light passes through a coloured solution some of the light is absorbed by the substances in the solution, and the rest passes through. Green solution absorbs light other then green 14

Sinar merah diabsorbsi Absorpsi sinar Sinar Monochromatic Sinar dari salah satu warna If white light is made to pass through a red filter, all light except red is filtered out and absorbed. Therefore, only red light hits the solution. Sinar merah diabsorbsi Oleh larutan hijau 15

Spektrofotometer The monochromatic light is obtained by allowing the beam of light to pass through a prism or diffraction grating (monochrometer) The monochromatic light is directed through a cuvette containing the sample, and the light that penetrates hits the photoelectric cell. The current developed by the photoelectric cell is translated into percent transmission or absorbance through a galvanometer. Then you can read the absorbance on the galvanometer. Absorbance is also called extinction and optical density In review, a spectrophotometer is used to measure the absorption of a certain color of light (specific wavelength) as it passes through a treated sample. A compound of interest is reacted with reagents creating a colored substance. It is the blockage or absorption of light by this secondary material (dye) that is actually measured. The amount of dye created is directly proportional to the amount of the compound of interest present in the sample. The original material’s concentration can be found by calculations or comparing the sample’s absorption to absorptions of various known strength solutions. 16

Susunan alat spektrofotometer UV/UV-visibel  1. Sumber radiasi Lampu D atau H : UV Lampu W atau Xe : UV-visibel 2. Sel Sampel  Kuvet kuarsa : UV dan UV - visibel Kuvet Plastik : UV- visibel  3. Monokromator Celah, lensa, cermin atau prisma Menyaring cahaya → monokromatis  4. Detektor Foton Energi yang ditangkap : energi foton (hv) Energi foton diubah menjadi energi listrik: pulsa listrik diperkuat oleh amplifier dan direkam oleh rekorder  5. Rekorder  Menampilkan out put : spektra atau angka

Peralatan: Monokhromator Cuvette Fotosel Celah Spektrofotometer pencatat otomatis

Dasar pengukuran radiasi, energi dan struktur kimia Sinar, panas dan radiasi elektromagnetik lain terdiri dari gelombang elektromagnetik yg merambat. Jumlah energi dlm masing-masing kuantum menentukan panjang gelombang dari radiasi. Seperti halnya atom, elektron dlm molekul dpt berubah tingkat energinya apabila sejumlah quanta radiasi diserap atau dilepaskan oleh molekul shg muncul istilah spektrum serapan dan lepasan.

Jenis spektrum dan kegunaannya Satu spektrum dpt digambarkan sbg suatu jumlah energi yg diserap atau dilepaskan oleh suatu sistem pd panjang gelombang atau bahan elektromagnetik yg lain. Macam spektrum: a. Spektrum elektronik: timbul karena elektron sebelah luar dr suatu atom berubah tingkat energinya. Spektrum elektronik terjadi dlm daerah nampak dan UV dan biasanya diikuti oleh perubahan tingkat energi rotasi dan vibrasi.

b. Spektrum getaran perputaran, disebabkan oleh adanya perubahan tingkat energi getaran. Spektrum ini terjadi pada daerah infra-merah-dekat dan mungkin diikuti oleh perubahan energi perputaran. c. Spektrum perputaran, terjadi dalam daerah infra-merah jauh dan microwave, dan ini jarang dipakai dlm penelitian biokimia. Spektrum resonansi perputaran elektron muncul karena perubahan arah perputaran elektron, sedang spektrum resonansi magnetik inti karena perubahan arah perputaran inti dlm medan magnet.

Hukum dasar penyerapan sinar Untuk bahan penyerap yg seragam, jumlah radiasi yg dpt lewat disebut transmitansi (T). T = I/Io I = jumlah kekuatan radiasi yg masuk Io = jumlah kekuatan radiasi yg dilepas Serapan (A), atau ekstingsi (E) A = log 1/T = log Io/I - Transmitansi dpt bernilai antara 0-100%, tetapi serapan tidak ada satuannya, berkisar antara 0 – tak terhingga. I

Spektrofotometri UV-VIS Spektrum yg diabsorpsi oleh suatu senyawa adalah sejumlah sinar yg diserap atau hilang oleh suatu senyawa pada panjang gelombang tertentu. Daerah spektrum nampak (400-700nm) dan UV (200-400nm) Peningkatan panjang gelombang disebut perpindahan batokhromik, sedangkan penurunan panjang gelombang disebut hipokhromik.

SPECTROPHOTOMETR READINGS

ULTRAVIOLET SPECTRUM

There is some A vs. C where graph is linear. NEVER extrapolate beyond point known where becomes non-linear.

SPECTROMETRIC ANALYSIS USING STANDARD CURVE Avoid very high or low absorbencies when drawing a standard curve. The best results are obtained with 0.1 < A < 1. Plot the Absorbance vs. Concentration to get a straight line