KLT-Densitometer

TLC (Thin Layer Chromatography) Pengembangan versi modern dari kromatografi kertas Kertas diganti oleh lapisan fasa diam (silika gel, alumina) berukuran (100-200 μm) yang dilapiskan pada kaca (10-20 cm) HPTLC = metode perkembangan terkini dari TLC Kelebihan: ukuran partikel fasa diam yang seragam Fasa diam termodifikasi Prosedur operasional yang otomatis reprodusibilitas lebih baik

Prosedur Derivatisasi Densitometri dengan scanner sinar UV Thin Layer chromatography (TLC) Proses Deteksi Analit (Komponen Sampel) Analit Berwarna Prosedur Derivatisasi Densitometri dengan scanner sinar UV UV light beam Detector Reflected beam Pseudo-chromatogram

KLT DENSITOMETER Metoda analisis instrumental yang berdasarkan interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan noda pada KLT Alat dilengkapi dengan spektrofotometer yang mempunyai radiasi sinar pada panjang gelombang 200 - 700 nm. Uji kualitatif dan kuantitatif dengan sistem absorbsi sinar atau emisi sinar (flouresensi)

*Chamber harus dijenuhkan dulu selama lebih kurang 30 menit dengan bantuan kertas saring. *Penguapan dari fase gerak dari permukaan lempeng, dalam chamber yang tidak jenuh akan menghasilkan Rf yang lebih besar, reproducibility hasil keterulangan Rf tak bagus dan permukaan fase gerak akan konkap. *Fase gerak yang tidak mau campur dengan sempurna akan menghasilkan chamber yang tidak jenuh

Lempeng Lempeng HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatografi) atau KLTKT (kromatografi lapis tipis Kinerja Tinggi) tidak dapat digunakan untuk preparatif (butuh lempeng cukup banyak), maka hanya untuk analisis kuantitatif Pelacak bercak untuk analisis kuantitatif dapat digunakan densitometer baik menggunakan pereaksi bercak lebih dulu maupun langsung menggunakan pelacak sinar ultra ungu, sinar tampak maupun sinar fluoresensi. (Didiskusikan tersendiri)

Teknik penggunaannya : - Pengukuran sinar yang diserap dan diteruskan (hanya untuk TLC dengan pendukung gelas), - Sinar yang diserap dan dipantulkan - Atau sinar yang dipendarkan. Susunan optik densitometer ini tidak banyak berbeda dengan spektrofotometer tetapi pada densitometer digunakan alat khusus reflection photomultiplier, sebagai pengganti photomultiplier pada spektrofotometer.

lnteraksi radiasi elektrornagnetik dengan noda pada KLT secara : Absorpsi Transmisi Pantulan (refleksi) Pemakaian “TLC Scanner (Densitometer)" makin banyak dipakai seiring dengan berkembangnya teknik kromatografi

Sumber Radiasi Spektrofotodensitometer memberikan rentang gelombang penentuan 200-630 nm. Lampu D2 (Deuterium) digunakan untuk pengukuran pada daerah ultraviolet sedangkan lampu tungsten untuk pengukuran pada daerah sinar tampak. Untuk penentuan pendar fluor dan pemadaman pendar fluor dipakai lampu busur Hg bertekanan tinggi. Pada densitometri juga dilakukan penentuan transmisi atau absorpsi dan refleksi pada panjang gelombang maksimal.  

Pada penentuan pendar fluor dan pemadaman pendar fluor diukur pada panjang gelombang dimana terjadi emisi atau intensitas relatif pendar fluor yang optimal. Monokromator dipakai monokromator kisi difraksi Detektor PMT (Photo Multiplier Tube = Tabung Penggandaan Foton) merupakan detektor umum yang dipakai pada densitometer.

Densitometri diutamakan untuk analisis kuantitatif analit-analit dengan kadar yang sangat kecil yang yang merupakan hasil pemisahan dengan KLT. Penentuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area noda pada KLT akan lebih terjamin kesahihannya dibanding metode KCKT (Kromatografi Cair kinerja Tinggi) atau KGC (Kromatografi Gas Cair). sebab area noda kromatogram diukur pada posisi lurus atau "Zig-zag" menyeluruh.

Bila REM (Radiasi Elektro Magnetik) dengan intensitas semula (I0) jatuh pada permukaan lapisan tipis yang tidak homogen dengan arah rambatan tegak lurus, maka sebagian dari REM tersebut akan: direfleksikan (Is) diserap oleh analit lapisan tipis (I) diteruskan (It). I=I0 + Is + It

Intensitas REM yang direfleksikan tergantung pada koefisien permukaan lapis tipis (E), yang dinyatakan sebagai : Is = I. E Harga E sangat dipengaruhi oleh jenis lapisan tipis yang dipakai. Selanjutnya akan didapat :  I0 =I-Is I0=I-I.E=(I-E)I Apabila lapisan tipis tersebut merupakan lapisan tipis yang homogen maka akan berlaku hukum Lambert Beer seperti pada spektrofotometri. It =I0. e-KX

E = koefisien permukaan lapis tipis ↓ Hk. Lambeert Beer → It = I0 E = koefisien permukaan lapis tipis ↓ Hk. Lambeert Beer → It = I0 . e-kt x = tebal medium lapis tipis k = koefisien absorbsi e-kt = berkurangnya I radiasi elektro magnetik yang melewati medium → “ Optical density” Parameter S (koef. Penghamburan) It =I0. e-KX

Oleh sebab itu pada metode spektrofoto-densitometri dikenal parameter : K (koefisien absorbsi) S (koefisien penghamburan).  Oleh karena adanya parameter S (koefisien penghamburan) inilah terjadi penurunan intensitas radiasi yang masuk medium lapis tipis yang dihamburkan oleh partikel-partikel fase diam.

Parameter S (koef. Penghamburan) Menyebabkan penurunan I radiasi yang masuk ke medium lapis tipis Sx = tiap pelat berbeda harganya = 0 -10 dl dx = + (S + K ) I + Sj - = - (S + K ) I + Sj dl dx +

Bagan Alat densitometer Gambar Sumber Sinar Photo multiflier Untuk refleksi Sinar polikromatis Sinar pantulan Sinar Mono kromator Monokromator Photomultiflier Untuk sinar yang diteruskan Densitometer single beam Densitometer double beam

Bagan konfigurasi densitometer cara sinar tunggal (a), ganda (b) PM Lempeng T S Mk I S Mk PM PS Lempeng ( a ) ( b ) Bagan konfigurasi densitometer cara sinar tunggal (a), ganda (b)

Cara Kerja Densitometer Lempeng yang telah digunakan untuk pemisahan. diuji dulu kedudukan setiap bercak pada sumbu(X,Y). agar sinar dapat tepat mengenai pusat bercak. Setelah tombol dihidupkan lempeng ditempat kan pada satu garis deretan Y, bercak diatur, dan gerakan lempeng diatur sesuai kedudukan bercak, menggunakan mikrokomputer. Panjang gelombang diprogram agar terjadi serapan secara maksimum, bila belum diketahui dilakukan scanning lebih dulu.

Scanning pengujian kuantitatif ada 2 cara : A. Cara memanjang Sinar dilewatkan pada tengah bercak, sehingga bercak hanya dideteksi sepanjang garis tengahnya sepanjang sumbu Y,(Y1 sampai Y2). Hasilnya baik bila bercak berbentuk bulat semetris. B. Sistem zig-zag Sistem ini diprogram berjalan memanjang sumbu Y tetapi berbelok -belok sampai garis tepi bercak pada garis X, sehingga bergerak dari Y1-Y2, dan X1-X2.

Pelacakan bercak, Gambar. Cara pelacakan bercak dengan TLC Scanner (a) Model zig-zag. ( b). model lurus Kelebihan penggunaan metode zig-zag lebih merata pengukurannya, apalagi delta Y menggunakan jarak terkecil. Kelemahannya waktu lebih lama, tetapi ketelitian pengukuran lebih terjamin dibanding penggunaan metode pengamatan lurus. y1 y2 a b x1 x2

Perhitungan luas atau tinggi puncak sudah dilakukan secara otomatis oleh alat, satuan luas area (mikro volt) yang tertera merupakan besaran puncak. Kadang-kadang prosentase yang tertulis hanya merupakan kadar relatif dari puncak yang muncul (tergambar). Dalam pengamatan lurus bila bercak nya tidak semitris akan kurang teliti sebab konsentrasi terbesar tidak selalu dilewati sinar pelacak bercak. Penotolan dengan bercak kecil kemungkinan molekul senyawa untuk mengumpul ditengah lebih banyak.

Panjang gelombang (nm) Analisis kualitatif hanya dapat dibandingkan waktu retensinya, atau dilakukan penyarian dari bercak setelah dielusi, dan kemudian diuji secara spektroskopi. Tetapi adanya densitometer, spektrogramnya dapat diuji. Analisis Kualitatif Sinar mono kromatis Propil spektrogram Intensitas Serapan ` Bercak Panjang gelombang (nm)

Cara Ekstraksi Bercak pada lempeng yang dilihat dibawah sinar UV diberi tanda (lingkari) dengan ujung pensil, kemudian diambil lapisan tipis bersama bercaknya. Lapisan yang diambil dimasukkan ke dalam gelas piala, ditambah pelarut yang sesuai (etanol/ kloroform), diaduk, dan setelah larut, disaring. Kedalam labu takar, dan cairan dijadikan volume sampai tepat tanda ( 10,0 ml). Larutan siap diuji dengan alat spektrofotometer.

Larutan yang didapat diuji dengan spektrofotometer pada panjang gelombang serapan maksimumnya. Karena pengenceran merupakan faktor penting untuk perhitungan kadar senyawa yang diuji secara kuantitatif segala caranya, Disaring Diencerkan Dilarutkan

TLC Plate HPTLC Plate

HASIL SCANNING SERENTAK HASIL ELUSI HASIL SCANNING SERENTAK BERCAK BAKU BERCAK SAMPEL SEBELUM ELUSI

Perbedaan TLC dan HPTLC Plate particle size: 10 - 25 µm 5 - 7 µm Separation distance: 100 - 150 mm 60 mm Development time: 30 - 200 min 3 - 20 min Application: manual automated/semi-automated Development: automated Derivatization: spraying dipping Analysis data: no documentation fully documented Quantitative analysis: no yes Environment: no control no problems Resolution: often poor very good Procedure: flexible fully standardized Reproducibility: impossible highly attainable cGMP Compliant: usually not YES!!

Thin Layer chromatography (TLC) Absorpsi radiasi UV proporsional (sebanding) dengan konsentrasi analit Menghitung kadar (kuantitatif) mungkin untuk dilakukan

Example: anthraquinone derivatives 4 major anthraquinone derivatives found in a species of indian rhubarb Varied bioactivities (antioxidant, antifungal, antimicrobial, antiviral, etc) Compound R1 R2 Physcion H OCH3 Chrysophanol H H Emodin H OH Chrysophanol Glc H Glycoside RP-18 thin layer methanol – water – formic acid 80:19:1 (v/v/v) UV-densitometry at 445 nm Singh et al., J. Chromatogr. A, 1077 (2005) 202-206