ELISA (Enzym-Linked Immunosorbent Assay)

Presentasi berjudul: "ELISA (Enzym-Linked Immunosorbent Assay)"— Transcript presentasi:

1 ELISA (Enzym-Linked Immunosorbent Assay)
Pertemuan ke empat

2 ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. tes immunochemical cepat yang melibatkan sebuah enzim (protein yang mengkatalisis suatu reaksi biokimia) dan melibatkan antibodi atau antigen (kekebalan molekul). Tes ELISA digunakan untuk mendeteksi zat yang memiliki sifat antigenik, terutama protein (sebagai lawan dari molekul kecil dan ion seperti glukosa dan kalium. Beberapa di antaranya adalah hormon, bakteri antigen dan antibodi.

3 Prinsip kerja ELISA sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang  tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.

4 Dalam penelitian dengan metode ELISA didasarkan pada ikatan spesifik antara antigen (Ag) dan antibody(Ab) yang terdiri dari : Teknik Qualitatif : Tiap berikatan pada Ag spesifik Teknik Quantitatif : Jumlah Ikatan Ag-Ab ditentukan dengan nilai absorbansi. Antibody pada elisa yaitu Antibodi yang disekresi oleh Sel Plasma (Sel B), Biasanya yang digunakan adalah monoklonal Antibody karena lebih spesifik untuk epitop tertentu daripada policlonal Antibodi. Dapat dibeli terpisah atau dalam paket ELISA Kit, biasanya diproduksi dengan cara induksi respon imun humoral pada hewan coba ( rat, mouse) dengan cara injeksi Antigen berulang, dengan dilakukan ekstraksi sel dan purifikasi Ab. Dapat juga diekstraksi dari manusia yang telah diimunisasi dengan Ag tertentu.

5 Tipe ELISA 1. direct ELISA
Biasanya digunakan dengan kompetisi dan inhibisi ELISA Deteksi Antigen 2. Indirect ELISA Ag terikat pada plate, deteksi antibodi 3. Sandwich ELISA Ab terikat pada plate, Deteksi Ag 4. ELISA kompetitif Antihuman terikat pada plate, deteksi Ab

6 Indirect ELISA Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam serum adalah: Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar  yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter.  Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.

7 Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya

8

9 Aplikasi ELISA ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodI dalam suatu sampel, karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi konsentrasi  antibodi  dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi kehadiran antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam indiustri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti susu, kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA  juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat.

10 Kelebihan Kekurangan teknik pengerjaan yang relatif sederhana Ekonomis
memiliki sensitivitas yang cukup tinggi. Kekurangan kemungkinan besar terjadinya hasil positif palsu, karena adanya reaksi silang antara antigen yang satu dengan antigen lain. Dan hasil negatif palsu dapat terjadi apabila uji ini dilakukan pada window period, yaitu waktu pembentukan antibodi terhadap suatu virus baru dimulai sehingga jumlah antibodi tersebut masih sedikit dan kemungkinan tidak dapat terdeteksi.