PENETAPAN POTYVIRUS ISOLAT INDONESIA

Presentasi berjudul: "PENETAPAN POTYVIRUS ISOLAT INDONESIA"— Transcript presentasi:

1 PENETAPAN POTYVIRUS ISOLAT INDONESIA
Reverse Transcriptase-polymerase Chain Reaction (RT- PCR) menggunakan primer spesifik Potyvirus RNA total diekstraksi dari tanaman nilam sumber Potyvirus menggunakan Rneasy Plant Mini Kits (Qiagen) First strand cDNA disintesa menggunakan oligo dT sebagai primer (Promega) Primer spesifik Potyvirus: MJ1 [5’-ATGGTHTGGTGTGYATHGARAAYGG-3’] dan MJ2 [5’-TGCTGCKGCKGCYTTCATYTG-3’] [Alpha DNA spore, Singapore] ukuran 327 bp

2 PENETAPAN DAN ANALISA SIKUEN GEN CP POTYVIRUS
AMPLIFIKASI GEN CP POTYVIRUS RNA total diekstraksi dari nilam sumber Potyvirus menggunakan Rneasy Plant Mini Kits (Qiagen) PCR menggunakan forward primer yang didesain di bagian upstream dan reverse primer di bagian downstream gen CP Potyvirus (acc. no. EU625351, GenBank) CP 31K 59K NIb 22; 27K VPg/Pro 6K 71K CI (Hel.) 41K 52K 33K P1 P3 HC-Pro Poly A VPg Ukuran ± nt

3 PENETAPAN DAN ANALISA SIKUEN GEN CP POTYVIRUS
PENENTUAN HUBUNGAN KEKERABATAN POTYVIRUS [GEN CP] Produk RT-PCR disikuen lansung [tanpa kloning] Sikuen gen CP Potyvirus isolat Indonesia dibandingkan dengan isolat-isolat dari negara lain Analisis pohon pilogeni dilakukan dengan program Clustal V

4 KLONING GEN CP POTYVIRUS DAN KONTRUKSI PLASMID VEKTOR EKSPRESI
Gen CP Potyvirus (gen virulen) diamplifikasi secara utuh [RT-PCR]: Forward primer didesain mulai dari start codon dan reverse primer diakhiri dengan stop codon dari ORF gen CP Pada ujung 3' forward primer ditambahkan sikuen CCATGG (NcoI) dan pada ujung 3' reverse primer ditambahkan sikuen GGTNACC (BstEII)

5 KLONING GEN CP POTYVIRUS DAN KONTRUKSI KIMERA PLASMID EKSPRESI
Gen CP [produk PCR ] disisipkan ke plasmid vektor pJET1.2 [melalui reaksi ligasi dan transformasi ke E.coli] Gen CP disisipkan ke plasmid vektor ekspresi pCAMBIA1301 [melalui pemotongan dengan ensim Ncol dan BstEII, purifikasi, ligasi] Hasil ligasi [pCAMBIA1301::gen CP] di transformasi ke sel kompeten E. coli [dikonfirmasi melalui seleksi koloni dengan kanamycin, isolasi DNA dan pemotongan DNA dengan ensim Ncol dan BstEII] DNA [pCAMBIA1301::gen CP] di transformasi ke sel kompeten A. tumefaciens LBA4404 [seleksi koloni dengan kanamycin, isolasi DNA dan pemotongan DNA dengan ensim yang unik]