ASAM NUKLEAT BAMBANG HERU BUDIANTO.

Presentasi berjudul: "ASAM NUKLEAT BAMBANG HERU BUDIANTO."— Transcript presentasi:

1 ASAM NUKLEAT BAMBANG HERU BUDIANTO

2 Asam nukleat adalah suatu polimer nukleotida yg berperanan dlm penyimpanan serta pemindahan informasi genetik (polinukleotida) Asam nukleat terdapat dlm 2 bentuk, yi. asam deoksiribosa (DNA) dan asam ribosa (RNA). Keduanya merupakan polimer linier, tidak bercabang dan tersusun dari subunit-subunit yg disebut nukleotida Pd sel eukariot, DNA terdapat di dlm nukleus, sedangkan pada sel prokariot, terdpt dlm sitoplasma atau nukleoid dan berfungsi sbg molekul hereditas atau pewarisan sifat. Molekul RNA disintesis dari DNA dan berperan dlm sintesis protein di dlm sitoplasma (ribosom) Satu nukleotida terdiri atas 3 bagian yi gula berkarbon 5 (pentosa), basa organik heterosiklik (mengandung karbon, nitrogen dan berbentuk datar) dan gugus fosfat bermuatan negatif, yg membuat polimer bersifat asam. Pada RNA gula pentosanya adalah ribosa, sedangkan pada DNA gula pentosanya mengalami kehilangan satu atom O pada posisi C nomor 2’ sehingga dinamakan gula 2’-deoksiribosa

3

4 Basa N, baik pada DNA maupun pada RNA, dapat dikelompokkan menjadi dua golongan, yaitu purin dan pirimidin. Basa purin mempunyai dua buah cincin (bisiklik), sedangkan basa pirimidin hanya mempunyai satu cincin (monosiklik). Pada DNA, dan juga RNA, purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G). Akan tetapi, untuk pirimidin ada perbedaan antara DNA dan RNA. Kalau pada DNA basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T), pada RNA tidak ada timin dan sebagai gantinya terdapat urasil (U). Timin berbeda dengan urasil hanya karena adanya gugus metil pada posisi nomor 5 sehingga timin dapat juga dikatakan sebagai 5-metilurasil. Di antara ketiga komponen monomer asam nukleat tersebut di atas, hanya basa N-lah yang memungkinkan terjadinya variasi.

5 Pada kenyataannya memang urutan (sekuens) basa N pada suatu molekul asam nukleat merupakan penentu bagi spesifisitasnya. Dengan perkataan lain, penggambaran suatu molekul asam nukleat hanya dengan menuliskan urutan basanya saja. Pada asam nukleat terbentuk ikatan glikosidik (glikosilik) dan fosfodiester Ikatan glikosidik terjadi karena adanya ikatan antara posisi 1’ pada gula dengan posisi 9 (N-9) pada basa purin atau posisi 1 (N-1) Suatu basa yang terikat pada satu gugus gula disebut nukleosida. Sedangkan, nukleotida sendiri adalah nukleosida dengan sebuah atau lebih gugus fosfat Jadi, apabila gulanya adalah ribosa, maka nukleosidanya dapat berupa adenosin (rA), guanosin (rG), sitidin (rC), dan uridin (rU). Nukleotidanya akan ada empat macam, yaitu adenosin monofosfat (AMP=asam adenilat), guanosin monofosfat (GMP= as guarilat), sitidin monofosfat (CMP=as sitidilat), dan uridin monofosfat (UMP= as uridilat)

6 Jika gula pentosanya adalah deoksiribosa seperti halnya pada DNA, nukleosidanya terdiri atas deoksiadenosin (dA), deoksiguanosin (dG), deoksisitidin (dC), dan deoksitimidin (dT). Sedangkan, nukleotidanya masing-masing adalah deoksiadenosin monofosfat (dAMP=as deoksiadenilat); deoksiguanosin monofosfat (dGMP=as deoksiguanilat); deoksisitidin monofosfat (dCMP=as deoksisitidilat) dan timidin monofosfat (TMP=as timidilat) Pada asam nukleat terdapat pula ikatan kovalen melalui gugus fosfat yang menghubungkan antara gugus hidroksil (OH) pada posisi 5’ gula pentosa dan gugus hidroksil pada posisi 3’ gula pentosa nukleotida berikutnya. Ikatan ini dinamakan ikatan fosfodiester karena secara kimia gugus fosfat berada dalam bentuk diester Basa purin dan pirimidin tidak berikatan secara kovalen satu sama lain Oleh karena itu, suatu polinukleotida tersusun atas kerangka gula-fosfat yang berselang-seling dan mempunyai ujung 5’-P dan 3’-OH. Adanya ujung-ujung tersebut menjadikan rantai polinukleotida linier mempunyai arah tertentu.

7

8 Telah dijelaskan bahwa penggambaran asam nukleat cukup dengan menuliskan urutan basa (sekuens)-nya saja Penulisan sekuens asam nukleat ada kebiasaan untuk menempatkan ujung 5’ di sebelah kiri atau ujung 3’ di sebelah kanan. Sebagai contoh, suatu sekuens DNA dapat dituliskan 5’-ATGACCTGAAAC-3’ atau suatu sekuens RNA dituliskan 5’-GGUCUGAAUG-3’. Sekuens tersebut juga menggambarkan arah pembacaannya Dua asam nukleat yang memiliki sekuens sama tidak berarti keduanya sama jika pembacaan sekuens tersebut dilakukan dari arah yang berlawanan (yang satu 5’→ 3’, sedangkan yang lain 3’→ 5’). Selain ikatan glikosidik dan fosfodiester, basa di dalam nukleotida membentuk ikatan hidrogen. Adenin akan membentuk 2 ikatan hidrogen dengan timin pada untai komplementer DNA double helix. Guanin membentuk 3 ikatan hidrogen dengan sitosin

9 Adanya ikatan hidrogen tersebut menjadikan kedua rantai polinukleotida terikat satu sama lain dan saling komplementer. Artinya, begitu sekuens basa pada salah satu rantai diketahui, maka sekuens pada rantai yang lainnya dapat ditentukan. DNA terdapat dlm bentuk heliks ganda (double helix) yg seragam dengan rantai-rantai komplementer yg berpilin satu sama lain membentuk tangga spiral ke arah kanan, sedangkan molekul-molekul RNA disintesis dari cetakan DNA sebagai untai tunggal. Namun, untai tunggal RNA juga dpt melipat ke rantainya sendiri dan membentuk pasangan basa komplementer yg menghasilkan struktur sekunder yg unik Ke dua untai komplementer dari heliks ganda DNA bekerja dengan arah yg berlawanan atau antiparalel. Jika salah satu rantai dibaca dari ujung fosfat 5’-nya, maka rantai lainnya akan dibaca dari ujung hidroksilnya 3’-nya. 3‛ membawa gugus –OH bebas pada posisi 3‛ dari cincin gula, dan ujung 5‛membawa gugus fosfat bebas pada posisi 5‛ dari cincin gula

10 Heliks ganda DNA akan membawa satu putaran setiap 10 pasangan basa (sekitar 3,4 nm)
Basa yg berpasangan terletak di tengah molekul, membentuk rongga hidrofobik sehingga lebar heliks menjadi sekitar 2 nm Bentuk DNA tersebut dikatakan berada dalam bentuk B atau bentuk yang sesuai dengan model asli Watson-Crick. Bentuk yang lain, misalnya bentuk A, akan dijumpai jika DNA berada dalam medium dengan kadar garam tinggi. Pada bentuk A terdapat 11 pasangan basa dalam setiap putaran spiral. Selain itu, ada pula bentuk Z, yaitu bentuk molekul DNA yang mempunyai arah pilinan spiral ke kiri. Bermacam-macam bentuk DNA ini sifatnya fleksibel, artinya dapat berubah dari yang satu ke yang lain bergantung kepada kondisi lingkungannya.

11

12 DNA dobel heliks dapat dikopi secara persis karena masing-masing untai mengandung sekuen nukleotida yang persis berkomplemen dengan sekuen untai pasangannya. Masing-masing untai dapat berperan sebagai cetakan untuk sintesis dari untai komplemen baru yang identik dengan pasangan awalnya.

13 Telah dijelaskan sebelumnya bahwa untai tunggal RNA juga dpt melipat ke rantainya sendiri dan membentuk pasangan basa komplementer yg menghasilkan struktur sekunder yg unik (ikatan hidrogen dlm molekulnya sendiri =intramolekuler). Adanya modifikasi struktur RNA menyebabkan adanya perbedaan fungsi Berdasarkan fungsinya, dikenal 3 jenis RNA yi RNA transfer (tRNA); RNA duta atau messenger (mRNA) dan RNA ribosom (rRNA) Struktur mRNA dikatakan sebagai struktur primer, sedangkan struktur tRNA dan rRNA dikatakan sebagai struktur sekunder t RNA mempunyai ukuran paling kecil (panjang nukleotida) dan berperan membawa asam amino ke ribosom untuk di-polimerisasi membentuk rantai polipeptida

14 RNA ribosom merupakan komponen struktural dari ribosom
RNA duta membawa sekuens ribonukleotida hasil transkripsi kode genetik pada salah satu untai DNA sehingga panjang dan komposisi mRNA sangat bervariasi Sifat-sifat fisika-kimia asam nukleat meliputi stabilitas asam nukleat, pengaruh asam, pengaruh alkali, denaturasi kimia, viskositas, dan kerapatan apung. Stabilitas asam nukleat ditentukan oleh interaksi penempatan (stacking interactions) antara pasangan-pasangan basa. Artinya, permukaan basa yang bersifat hidrofobik menyebabkan molekul-molekul air dikeluarkan dari sela-sela perpasangan basa sehingga perpasangan tersebut menjadi kuat. Di dalam asam pekat dan suhu tinggi, misalnya HClO4 dengan suhu lebih dari 100ºC, asam nukleat akan mengalami hidrolisis sempurna menjadi komponen-komponennya. Namun, di dalam asam mineral yang lebih encer, hanya ikatan glikosidik antara gula dan basa purin saja yang putus sehingga asam nukleat dikatakan bersifat apurinik

15 Pengaruh alkali terhadap asam nukleat mengakibatkan terjadinya perubahan status tautomerik basa.
Sebagai contoh, peningkatan pH akan menyebabkan perubahan struktur guanin dari bentuk keto menjadi bentuk enolat karena molekul tersebut kehilangan sebuah proton. Selanjutnya, perubahan ini akan menyebabkan terputusnya sejumlah ikatan hidrogen sehingga pada akhirnya rantai ganda DNA mengalami denaturasi. Hal yang sama terjadi pula pada RNA. Bahkan pada pH netral sekalipun, RNA jauh lebih rentan terhadap hidrolisis bila dibadingkan dengan DNA karena adanya gugus OH pada atom C nomor 2 di dalam gula ribosanya. Sejumlah bahan kimia diketahui dapat menyebabkan denaturasi asam nukleat pada pH netral. Contoh yang paling dikenal adalah urea (CO(NH2)2) dan formamid (COHNH2). Pada konsentrasi yang relatif tinggi, senyawa-senyawa tersebut dapat merusak ikatan hidrogen. Artinya, stabilitas struktur sekunder asam nukleat menjadi berkurang dan rantai ganda mengalami denaturasi.

16 Molekul DNA sangat rentan terhadap fragmentasi fisik karena relatif kaku sehingga larutan DNA mempunyai viskositas yang tinggi Analisis dan pemurnian DNA dapat dilakukan sesuai dengan kerapatan apung (bouyant density)-nya. Di dalam larutan yang mengandung garam pekat dengan berat molekul tinggi, misalnya sesium klorid (CsCl) 8M, DNA mempunyai kerapatan yang sama dengan larutan tersebut, yakni sekitar 1,7 g/cm3. Jika larutan ini disentrifugasi dengan kecepatan yang sangat tinggi, maka garam CsCl yang pekat akan bermigrasi ke dasar tabung dengan membentuk gradien kerapatan. Begitu juga, sampel DNA akan bermigrasi menuju posisi gradien yang sesuai dengan kerapatannya. Teknik ini dikenal sebagai sentrifugasi seimbang dalam tingkat kerapatan (equilibrium density gradient centrifugation) atau sentrifugasi isopiknik.

17 Dengan teknik sentrifugasi tersebut DNA, RNA, dan protein akan terpisah.
Pelet RNA akan berada di dasar tabung dan protein akan mengapung sehingga DNA dapat dimurnikan, baik dari RNA maupun protein. Selain itu, teknik tersebut juga berguna untuk keperluan analisis DNA karena kerapatan apung DNA (ρ) merupakan fungsi linier bagi kandungan GC-nya. Dalam hal ini, ρ = 1,66 + 0,098% (G + C). Selain sifat fisik-kimia di atas, sifat spektroskopik-termal asam nukleat meliputi kemampuan absorpsi sinar UV, hipokromisitas, penghitungan konsentrasi asam nukleat, penentuan kemurnian DNA, serta denaturasi termal dan renaturasi asam nukleat.

18 Sentrifugasi seimbang dalam tingkat kerapatan
protein sentrifugasi CsCl 8M DNA RNA

19 Asam nukleat dapat mengabsorpsi sinar UV karena adanya basa nitrogen yang bersifat aromatik
Panjang gelombang untuk absorpsi maksimum baik oleh DNA maupun RNA adalah 260 nm atau dikatakan λmaks = 260 nm. Meskipun λmaks untuk DNA dan RNA konstan, namun ada perbedaan nilai absorbansi (hipokromisitas). Molekul dsDNA dikatakan relatif hipokromik (kurang berwarna) bila dibandingkan dengan ssDNA. Sebaliknya, ssDNA dikatakan hiperkromik terhadap dsDNA. Konsentrasi DNA dihitung atas dasar nilai A260-nya Molekul dsDNA dengan konsentrasi 1 mg/ml mempunyai A260 sebesar 20, sedangkan konsentrasi yang sama untuk molekul ssDNA atau RNA mempunyai A260 lebih kurang sebesar 25. Nilai A260 untuk ssDNA dan RNA hanya merupakan perkiraan karena kandungan basa purin dan pirimidin pada kedua molekul tersebut tidak selalu sama, dan nilai A260 purin tidak sama dengan nilai A260 pirimidin. Pada dsDNA, yang selalu mempunyai kandungan purin dan pirimidin sama, nilai A260 -nya sudah pasti.

20 Tingkat kemurnian asam nukleat dapat diestimasi melalui penentuan nisbah A260 terhadap A280
Molekul dsDNA murni mempunyai nisbah A260 /A280 sebesar 1,8. Sementara itu, RNA murni mempunyai nisbah A260 /A280 sekitar 2,0. Nisbah protein (λmaks = 280 nm) , kurang dari 1,0. Oleh karena itu, suatu sampel DNA yang memperlihatkan nilai A260 /A280 lebih dari 1,8 dikatakan terkontaminasi oleh RNA. Sebaliknya, suatu sampel DNA yang memperlihatkan nilai A260 /A280 kurang dari 1,8 dikatakan terkontaminasi oleh protein Selain bahan-bahan kimia, panas juga dapat menyebabkan denaturasi asam nukleat Denaturasi termal pada DNA dan RNA ternyata sangat berbeda

21 Pada RNA denaturasi berlangsung perlahan dan bersifat acak karena bagian rantai ganda yang pendek akan terdenaturasi lebih dahulu daripada bagian rantai ganda yang panjang. Pada DNA, denaturasi terjadi sangat cepat dan bersifat koperatif karena denaturasi pada kedua ujung molekul dan pada daerah kaya AT akan mendestabilisasi daerah-daerah di sekitarnya. Suhu ketika molekul asam nukleat mulai mengalami denaturasi dinamakan titik leleh atau melting temperature (Tm). Nilai Tm merupakan fungsi kandungan GC sampel DNA, dan berkisar dari 80 ºC hingga 100ºC untuk molekul-molekul DNA yang panjang DNA yang mengalami denaturasi termal dapat dipulihkan (direnaturasi) dengan cara didinginkan Renaturasi yang terjadi antara daerah komplementer dari dua rantai asam nukleat yang berbeda dinamakan hibridisasi.

22 Banyak molekul dsDNA berada dalam bentuk sirkuler tertutup atau closed-circular (CC), misalnya DNA plasmid dan kromosom bakteri serta DNA berbagai virus. Artinya, kedua rantai membentuk lingkaran dan satu sama lain dihubungkan sesuai dengan banyaknya putaran heliks (Lk) di dalam molekul DNA tersebut. Banyaknya putaran heliks yang terbentuk akan mengunci sistim pilinan tersebut. Deformasi inilah yang disebut sebagai superkoiling. Geometri suatu molekul yang mengalami superkoiling dapat berubah akibat beberapa faktor yang mempengaruhi pilinan internalnya Sebagai contoh, peningkatan suhu dapat menurunkan jumlah pilinan, atau sebaliknya, peningkatan kekuatan ionik dapat menambah jumlah pilinan Contoh : keberadaan interkalator seperti etidium bromid (EtBr) yang menyisip di antara pasangan-pasangan basa