BIOLOGI MOLEKULAR.

Presentasi berjudul: "BIOLOGI MOLEKULAR."— Transcript presentasi:

1 BIOLOGI MOLEKULAR

2 ORGANISASI BIOLOGIS JASAD HIDUP
Jasad hidup secara umum dikelompokan menjadi dua : Jasad hidup selular : mempunya satuan unit dasar yaitu sel Misalnya : bakteri, hewan tingkat tinggi, tanaman tingkat tinggi Jasad hidup non selular : Tidak tersusun atas sel tapi berupa satuan Misalnya virus dan bakteriofag. Virus satuan dasarnya adalah virion JASAD NON SELULAR VIRUS Virus adalah suatu partikel yang mengandung bahan genetik berupa DNA atau RNA yang diselubungi oleh protein yang disebut dengan kapsid dan pada beberapa jenis virus ada juga komponen lain, misalnya lemak. Satuan dasar virus disebut virion. Diameternya nm jauh lebih kecil dari sel prokariot yang paling kecil. Klasifikasi virus berdasarkan sel inangnya Virus hewan Virus tumbuhan Virus bakteri (bagteriofag)‏

3 Disamping virus DNA atau RNA, ada partikel yang lebih sederhana dari virus yaitu viroid dan prion
Viroid molekul kecil RNA yang terdiri atas 359 basa nukleotida dan tidak diselubungi oleh protein contohnya viroid yang menyebabkan penyakit panda kentang Prion suatu partikel yang terdiri atas molekul kecil protein (ada yang terdiri atas 250 asam amino) yang tidak mempunyai asam nukleat Prion berasal dari istilah proteinaceous infectious particle (artikel atau molekul protein sebagai agen penyebab penyakit) oleh Stanley B Prusiner. Contoh prion : Penyebab penyakit neurogeneratif - Penyakit BSE (bovine spongiform encephalophaty), penyakit sapi gila - Penyakit scrapie pada domba - Penyakit creutzfeldt-jacob pada manusia - Penyakit Gerstmann-Straussler-scheinker pada manusia

4 Virus bersifat parasit
Virus bersifat parasit. Bisa memperbanyak diri jika berada didalam suatu sel inang yang sesuai. Jika berada diluar sistem selular, maka virus tidak bisa memperbanyak diri karena tidak mempunyai suatu sistem enzim yang dapat digunakan untuk sintesis partikel virus baru. Dibawah ini beberapa gambaran skematik beberapa jenis virus

5 Meskipun bersifat parasit
Meskipun bersifat parasit. Namun dalam perkembangan genetik molekular, telah dilakukan exploitasi virus untuk kepentingan kepentingan praktis. Misalnya untuk kepentingan militer : senjata biologis medis, pengobatan kanker, dll Salah satu protein prion ada yang bisa menyebabkan apoptosis. Apoptosis : Progam kematian sel secara normal, dengan cara menghilangkan sel yang tidak diinginkan. Prinsip inilah yang digunakan dalam pencarian obat antikanker

6 Strain AF 2400 Pada pengobatan Kanker payudara Mekanismenya yaitu
Contoh penggunaan Virus yaitu virus NDV Strain AF 2400 Pada pengobatan Kanker payudara Mekanismenya yaitu Menyerang protein Filamen sel A A’ B C B’ C’

7 JASAD SELULAR Doktrin sel Istilah sel pertama kali dikemukakan oleh Robert Hooke ( ). Sel merupakan satuan dasar minimum suatu jasad hidup Doktrin sel : Semua sel berasal dari sel yang sudah ada sebelumnya dan masing masing sel mempunyai suatu sistem kehidupan sendiri Sel bersifat dinamis yang selalu mengalami perubahan ( adanya proses transformasi selular yang melibatkan macam macam reaksi molekular Pengaturan selular yang dilakukan oleh sel memiliki 2 fungsi utama Sebagai piranti kimiawi yang melakukan proses metabolisme Sebagai piranti yang menyimpan kode kode informasi biologis yang akan diturunkan kepada keturunannya.

8 Penggolongan jasad selular berdasarkan satuan dasar individu :
1. Jasad bersel tunggal (unicellular organism)‏ 2. Jasad bersel banyak (multicellular organism)‏ Penggolongan jasad selular berdasarkan struktur dan organisasi sel : Sel prokariot tanpa membran inti Sel eukariot ada membran inti Penggolongan jasad selular Escheria coli Saccharomyces cerevisiae Manusia, hewan, tanaman tingkat tinggi Prokariot Eukariot Sel tunggal Sel banyak Contoh Organisasi sel Satuan dasar

9 Sel Jasad Prokarot Secara organisasi sel prokariot lebih sederhana dibandingkan dengan jasad eukariot. Sel prokariot terdiri atas struktur utama : dinding sel, membran plasma sel , ribosom dan bahan genetik (nukleoid)‏ Tidak adanya membran inti sel (nukleus)‏ Contohnya yaitu kelompok bakteri, berdasarkan lingkungan tempat hidup dibagi 2 yaitu eubakteria dan archaebakteri Berdasarkan dinding sel prokariot, misalnya bakteri, bakteri dibedakan menjadi 2 kelompok yaitu bakteri gram positif (bacillus substilis) dan bakteri gram negative (E. coli). Beberapa jenis organisme prokariot pada bakteri ada struktur tambahan diluar dinding sel ---- kapsulntuk. Sehingga memberikan bentuk yang bermacam-macam seperti kokus batang, spiral dan lain lain Memiliki satu/single molekul DNA dan berbentuk sirkular Membran plasma terdiri dari campuran lemak dan protein (lipoprotein).Berfungsi sebagai selaput sel yang bersifat semipermeable yang mengatur keluar masuknya ion ion dan molekul.

10 Pada sel prokariot, jenis bakteri gram positif membran plasma membentuk lipatan yang dikenal sebagai mesosom.Pada bagian yang menghadap sitoplasma mesosom sering berasosiasi dengan DNA sehingga sering diduga sebagai tempat pelekatan DNA Ribosom merupakan partikel kecil yang dominan terdiri dari RNA dan protein yang berfungsi sebagai wadah tempat translasi protein (pada sisntesis protein. Satu sel dapat mengandung ribosom sehingga massanya dapat mencapai 40% massa bakteri. Materi genetik selain DNA , seringkali ada materi genetik tambahan yang disebut plasmid. Ukuran sel prokariot bervariasi, berdiameter 5 mm – 750 mm. Sama seperti eukariot. Beberapa bakteri juga membentuk struktur khusus yaitu flagella atau endospora. Beberapa contoh bakteri yang telah digunakan dalam bidang biologi molekular : Escherichia coli, salmonella typhimurium, streptomyces sp, Rhizobium sp, Bacillus substilis, agrobacterium tumafaciens, dll

11 Diagram sel prokariot

12 Sel Jasad Eukariot Mempunyai struktur dan organisasi yang lebih kompleks dibandingkan sel prokariot. Pada jasad sel eukariot, bahan genetiknya (DNA) berada didalam suatu membran nukleus sehingga memiliki struktur nukleus yang jelas. Membran nukleus eukariot memiliki 2 lapisan, membran luar dan membran dalam. Struktur membran nukleus akan menjadi salah satu pembeda antara eukariot dan prokariot. Pada eukariot, bahan genetik utamanya umumnya terdiri dari lebih dari satu kromososm yang berbentuk linear yang dikemas dalam protein yang disebut histon. Sudah memiliki pembagian ruang yang jeals dalam sel, sehingga memiliki bermacam macam organel yang masing masing memiliki fungsi khusus. Pada sel eukariot dari sel tumbuhan, struktur sel terluarnya ada dinding sel yang terdiri atas polimer selulosa (Jenis polisakarida).

13 Beberapa organel penting pada eukariot antara lain mitokhondria
(tempat produksi energi selular), retikulum endoplasma (RE) kasar( berperan dalam proses sekresi protein dan tempat lekat ribosom), RE halus (tempat detoksifikasi senyawa tertentu dan sintesis lemak), badan golgi (berperan dalam sekresi dan pemilahan protein), Pada tumbuhan ada kloroplas (tempat berlangsungnya reaksi fotosintesis), vacuola (tempat penyimpanan air dan produk metabolisme)‏ Salah satu eukariot yang banyak digunakan dalam studi biology molekular adalah khamir sacharomyces cerevisiae (jenis bersel satu yang mudah ditumbuhkan untuk industri minuman Sebagai inang untuk memproduksi protein heterolog dan vaksin

14

15 Smooth Endoplasmic Reticulum Ribosome

16 Description & Function
I. Membrane-bound organelles X Kantung membran yang mengandung enzim enzim, untuk bermacam macam reaksi. Mikrobodi Structur serupa kantung dengan membrane tilakoid internal; tempat photosynthesis Plastida Kantung, terdiri dari 2 membran; bagian siklus Krebs cycle, sistem transport elektron, pabrik energi, chemiosmosis. Mitochondria Kantung membran; transpor and penyimpanan air & material lainnya Vakuola Kantung membran; mengandung enzim untuk mencernakan material Lisosom Saluran membran berbentuk kantung datar ; modifies, pemilihana & sekresi protein Kompleks Golgi Jaringan internal membran; bagian dari lipid membran & sinthesis protein Reticulum Endoplasma Butiran inti pada nukleus; bagian of sintesis r-RNA Nukleolus Large structure surrounded by double membrane; species cellular proteins Nukleus Membran pembungkus cell, regulator transport sel Membran Plasma Found in Plants? Found in Animals? Description & Function Structure

17 Description & Function Description & Function
II. Particulate Structures X Proyeksi panjang /ekor; selular lokomotif, biasanya 1-5 pada sell. Flagella Struktur berambut pendek; pergerakan, pengambilan makanan, biasanya jumlahnya >>1 pada sel. Silia Lekukan silinder kecil; terlibat dalam pembelahan sel & melekatnya flagellae & silia Sentriol Padat, struktur batanagn dari actin, struktur penyokong Mikrofilament Cekungan dari tabung tubulin; struktur penyokong untuk pergerakan organel Mikrotubul Butiran organel terdiri dari RNA & protein; sintesis proteins Ribosom Kandungan DNA-protein komplex; mengandung gen - gen Kromosom Found in Plants? Found in Animals? Description & Function Structure III. Extracellular structures X Multiple-layers dari selulosa; struktur pendukung Dinding sel Found in Plants? Found in Animals? Description & Function Structure

18 INTERAKSI MAKROMOLEKUL GENETIK
ASAM NUKLEAT Adalah polimer nukleotida yang berperanan dalam penyimpanan serta pemindahan informasi genetik . Satu unit monomer terdiri dari ketiga komponen dinamakan nukleotida terdiri atas tiga bagian yaitu :

19 Struktur dasar nukleotida
Basa nitrogen : cincin purin atau pirimidin Yaitu basa nitrogen yang terikat pada atom C no 1 suatu molekul gula (ribosa atau deoksiribosa) melalui ikatan N-glikosidik. Ada dua macam basa nitrogen yang menyusun asam nukleat yaitu - Basa purin terdiri dari adenin (A) dan guanine (G)‏ - Basa pirimidin terdiri dari Thymine (T), cytosine (C ) dan Uracil (U).

20 Baik DNA ataupun RNA tersusun atas A, G, C, tetapi T hanya ada pada DNA sedangkan U hanya ada pada RNA. Ada pengecualian, ada beberapa molekul tRNA terdapat basa T, sedangkan pada beberapa bakteriofag DNA-nya tersusun ats U bukan basa T. Beberapa struktur dasar basa nitrogen asam nukleat

21 deoxythymidine (thymidine)‏
RNA uridine Uracil U DNA deoxythymidine (thymidine)‏ Thymine T cytidine deoxycytidine Cytosine C guanosine deoxyguanosine Guanine G adenosine deoxyadenosine Adenine A Nucleic Acid Nucleoside Base Abbr. 2. Molekul gula dengan 5 atom C (pentosa)‏ Pasa DNA gulanya adalah gula pentosa yaitu 2-deoksirobosa dan pada RNA gulanya adalah ribosa. Perbedaan anatar kedua bentuk gula tersebut yaitu panda atom C no 2.Pada DNA atom C no 2 berikatan dengan atom H, sedangkan panda RNA atom C no 2 berikatan dengan OH.

22 Dua gugus gula terhubung dengan fosfat melalui ikatan fosfodiester
3. Gugus fosfat Dua gugus gula terhubung dengan fosfat melalui ikatan fosfodiester antara atom karbon ketiga pada cincin satu gula dan atom karbon kelima pada gula lainnya. . Gugus fosfat inilah yang menyebabkan asam nukleat bermuatan negatif kuat. Untaian nukleotida = polinukleotida DNA dan RNA disintesis dalam sel oleh DNA polymerase and RNA polymerases. Untaian pendek dari asam nukleat juga dihasilkan tanpa enzyme oleh oligonucleotida synthesizers PASANGAN BASA DAN DOUBLE STRANDED ASAM NUKLEAT Sebagian besar DNA berada dalam bentuk double helix, yang mana terdiri dari 2 linear DNA yang berikatan berputar satu sama lainnya. Ikatan utama yang membentuk formasi helix ini adalah ikatan antara pasangan basa : bentuk basa A berikatan hydrogen dengan basa T (or U in RNA), dan basa G berikatan hydrogen dengan C. Jika kita campurkan dua ATGC bersamaan , bentuk duplex akan terbentuk

23

24 PENEMUAN STRUKTUR MOLEKULAR DARI DNA DOUBLE HELIX
Struktur dari Deoxyribose Nucleic Acid (DNA) pertama kali dipublkasikan oleh James D. Watson and Francis crick dalam jurnal : scientific jurnal Nature volume 171 pada halaman (tanggal 25 April 1953). Publicasi pertama yang menggambarkan penemuan struktur double helix DNA. Penemuan ini memberikan impact yang utama pada bidang genetik khususnya dan biologi secara umumnya

25 Telah dijelaskan bahwa penggambaran asam nukleat cukup dengan menuliskan urutan basa (sekuens)-nya saja Penulisan sekuens asam nukleat ada kebiasaan untuk menempatkan ujung 5’ di sebelah kiri atau ujung 3’ di sebelah kanan. Sebagai contoh, suatu sekuens DNA dapat dituliskan 5’- ATGACCTGAAAC-3’ atau suatu sekuens RNA dituliskan 5’- GGUCUGAAUG-3’. Sekuens tersebut juga menggambarkan arah pembacaannya Selain ikatan glikosidik dan fosfodiester, basa di dalam nukleotida membentuk ikatan hidrogen. Adenin akan membentuk 2 ikatan hidrogen dengan timin Guanin membentuk 3 ikatan hidrogen dengan sitosin Adanya ikatan hidrogen tersebut menjadikan kedua rantai polinukleotida terikat satu sama lain dan saling komplementer. Jika salah satu rantai dibaca dari ujung fosfat 5’-nya, maka rantai lainnya akan dibaca dari ujung hidroksilnya 3’-nya. DNA dobel heliks dapat dikopi secara persis karena masing-masing untai mengandung sekuen nukleotida yang persis berkomplemen dengan sekuen untai pasangannya. Masing-masing untai dapat berperan sebagai cetakan untuk sintesis dari untai komplemen baru yang identik dengan pasangan awalnya.

26 Pada replikasi DNA, rantai DNA baru dibentuk berdasarkan urutan nukleotida pada DNA yang digandakan.
DNA terdiri atas dua untai yang berpilin membentuk struktur helix ganda. Pada struktur heliks ganda, orientasi rantai nukleotida pada satu untai berlawanan dengan orientasi nukleotida untai lainnya. Hal ini disebut sebagai antiparalel

27 Interaksi Molekular Semua molekul dalam sel alkan berinteraksi satu sama lain. Interaksi antar molekul akan menentukan sifat sifat biologis molekul molekul didalam sel. Ineraksi milekular tersebut berupa : Ikatan kovalen : Ikatan yang ada diantara atom atom yang menyusun suatu molekul, misalnya ikatan antara C – H pada CH4. Ikatan ini paling kuat dan paling stabil antara atom. 2. Ikatan non kovalen : Interaksi antara atom yang tidak teriakt secara kovalen. Ikatan nya tidak sekuat ikatan kovalen, namun berperan penting dalam menstabilkan struktur makromolekul dalam sel misalnya asam nukleat dan protein Beberapa ikatan nonkovalen yang penting Ikatan hidrogen Suatu bentuk interaksi lemah antara suatu atom elektronegatif (atom akseptor) dengan hidrogen yang terikat secara kovalen dengan atom lain (donor atom)

28 Ikatan hidrogen banyak terdapat panda sistem biologis
Ikatan hidrogen banyak terdapat panda sistem biologis. Pada asam nukleat ikatan hidrogen menyebabkan terjadinya pasangan antar untaian (interstrand) antar basa nukleotida Misalnya antara adenine dan tymine (A-T) dan antara guanosine dengan cytosine (G-C)‏ 2. Ikatan ionik Ikatan antara atom yang terjadi karena adanya perbedaan muatan pada atom atom yang berinteraksi. Contoh amino aspartat dan glutamat yang bermuatan – , sedangkan lisin, histidin, dan arginin bermuatan + , muatan yang berbeda ini menyebabkan asam amino berikatan ionik. Hal ini yang menyebabkan rantai polipeptida protein dapat berlipat sedemikian rupa, sehingga menjadi lebih bedekatan 3. Interaksi van der waals Terjadi pada jarak atom yang sangat berdekatan 1-2 oA. Terjadi karena distribusi muatan yang tidak simetris. Energi ikatan panda van der waals panda sepasang atom < 1 kcal/mol. Energi ini lebih kecil dibandingkan ikatan hidrogen Contohnya : molekul antibodi dengan molekul antigen spesifiknya antara enzim dengan substratnya yang spesifik.

29 4. Interaksi hidrofobik. Molekul hidrofobik merupakan molekul molekul nonpolar yang tidak larut dalam air. Gugus samping alifatik dan aromatik suatu protein dan basa basa pada asam nukleat mempunyai sifat nonpolar. Interaksi hidrofobik merupakan kekuatan utama yang menyebabkan terjadinya pelipatan makromolekul misalnya protein dan pembentukan membran.

30 Ribonucleic acid (RNA) asam ribonukleat Berantai tunggal
ASAM RIBO NUKLEAT (RNA)‏ Ribonucleic acid (RNA) asam ribonukleat Berantai tunggal Disusun oleh asam nukleat (polinukleotida) Gula : Ribosa Basa nitrogen : A,C,G, dan Urasil (pada DNA adalah Timin) Fosfat Berarti susunan : A, C, G, U RNA hadir di alam dalam berbagai macam/tipe Sebagai bahan genetik, RNA berwujud sepasang pita (Inggris double-stranded RNA, dsRNA). Genetika molekular klasik mengajarkan adanya tiga tipe RNA yang terlibat dalam proses sintesis protein:

31 Macam-macam RNA mRNA (massenger) terdapat dalam nukleus. mRNA dicetak oleh salah satu pita DNA yg berlangsung dalam nukleus tRNA (transfer) terdapat dalam sitoplasma. Seperti daun semanggi rRNA (ribosom) terdapat dalam ribosom. Molekulnya berupa pita tunggal tidak bercabang Pada akhir abad ke-20 dan awal abad ke-21 diketahui bahwa RNA hadir dalam berbagai macam bentuk dan terlibat dalam proses pascatranslasi. Dalam pengaturan ekspresi genetik orang sekarang mengenal RNA-mikro (miRNA) yang terlibat dalam "peredaman gen" atau gene silencing dan small-interfering RNA (siRNA) yang terlibat dalam proses pertahanan terhadap serangan virus

32 Telah dijelaskan sebelumnya bahwa untai tunggal RNA juga dpt melipat ke rantainya sendiri dan membentuk pasangan basa komplementer yg menghasilkan struktur sekunder yg unik (ikatan hidrogen dlm molekulnya sendiri =intramolekuler). Adanya modifikasi struktur RNA menyebabkan adanya perbedaan fungsi Berdasarkan fungsinya, dikenal 3 jenis RNA: RNA transfer (tRNA); RNA duta atau messenger (mRNA) dan RNA ribosom (rRNA) Struktur mRNA dikatakan sebagai struktur primer, sedangkan struktur tRNA dan rRNA dikatakan sebagai struktur sekunder t RNA mempunyai ukuran paling kecil (panjang nukleotida) dan berperan membawa asam amino ke ribosom untuk di-polimerisasi membentuk rantai polipeptida

33 Fungsi RNA mRNA bertugas menerima informasi/keterangan genetik dari DNA. Proses ini dinamakan transkripsi dan berlangsung dalam nukleus. Berfungsi sbg perantara ant DNA krom dan asam amino sitoplasma. Berperan penting dlm pembuatan protein tRNA bertugas mengikat asam amino yang terdapat dalam sitoplasma. Sebelum dapat diikat oleh tRNA, asam animo berekasi terlebih dahulu dg ATP supaya berenergi dan aktif. tRNA membawa asam amino yg diikat itu ke ribosom. Disinilah berlansung perubahan informasi genetik yg dinyatakan oleh urutan basa dari mRNA ke urutan asam amino dlm protein yg dibentuk. Proses perubahan ini disebut Translasi rRNA bertugas mensintesa protein dg menggunakan asam amino. Proses ini berlangsung dlm ribosom dan hasil akhirnya adalah polipeptida

34 Metoda dasar yang digunakan dalam bidang biologi molekular
Pada dasarnya pada studi biomolekular ini berkaitan dengan analsis makro molekular. Beberapa metoda dasar dalam studi molekular A. Penggunaan radioisotop Isotop adalah elemen elemen kimia yang mempunyai jumlah proton yang sama dalam inti atom, namun memiiki no massa yang berbeda (proton dan neutron)‏ contohnya : - S35 digunakan untuk melabel protein atau melabel nukleotida yang digunakan dalam penentuan urutan basa DNA (DNA sequensing)‏ - [α-P32] UTP-RNA : digunakan dalam translasi dan transkripsi in vivo guna mempelajari promoter suatu gen yang mengatur proses transktripsi. - [α-S35]dATP atau [α-P32dATP juga untuk analisis urutan basa nukleotida sehingga dapat membaca autoradioaktivitas frgament fragment nukelotida panda gel elektroforesis.

35 Untuk mendeteksi berbagai jenis penyakit
seperti : a. 24Na untuk mendeteksi adanya gangguan peredaran darah b. 50Fe untuk menetahui laku pembentukan sel darah merah c. 131I untuk mendeteksi getah tiroid dalam kelenjer gondok d. 60Co untuk terapi pengobatan kanker e. 201Ti untuk mendeteksi kerusakan jantung f. 32P untuk mendeteksi penyakit mata,tumor, hati,menghambat pembetukan sel darah merah yang berlebih g. 133Xe untuk mendeteksi penyakit paru paru h. 99Tc untuk mendeteksi tulang manusia Pada dasarnya ada 2 cara untuk mendeteksi radioaktifitas pada hasil suatu reaksi biokimia molekular yang dilakukan dengan menggunakan bahan radioaktif Yaitu : 1. Dengan prinsip autoradiografi : pada penetuan urutan basa DNA atau frgamen DNA. HAsilnya kemudian dielektroforesis pada gel poliakrilamide. Selembar film sunar X diletakan diatas gel poliakrilamide tersebut, sehingga radioaktifitas yang memancar dari gel akan mengenai lembar sinar X tersebut akan membentuk citra sesuai dengan pola urutan fragment polinikleotida

36 Contoh : ekspresi dari onkogen c-myc pada sel kanker rahim setelah diobati 72 jam dengan ekstrak neem Figure 10. Efek dari xtract ethanol dari A.indica (neem) thd ekpresi gen c-myc pada sel kanker rahim (HeLa). . Note: s is standard, n is normal control (housekeeping genes), ut is untreated and t is treated

37 Morphology of Hela cells were stained by TUNEL assay view under LCSM
Figure 5 : Confocal micrograph of LCSM . A control of HeLa cells, B shows condensation of nucleus, C shows membrane blebbing, D shows morphological starting of nucleus fragmentation, E shows nuclear fragmentation and F shows nuclear break-down dan form apoptotic body

38 Apoptotic DNA laddering
Figure 9 : DNA Ladder assayed with apoptoric DNA laddering kits. Line N DNA mix ladder. Line 1 Hela untreated, line 2 Hela treated cells by EtOh leaves extract of A. indica

39 2. Radiokativitas dapat juga diukur dengan menggunakan alat yang disebut
dengan Geiger-muller counter atau dengan scintillation counter. Geiger muller dapat digunakan untuk mendeteksi isotop yang memancarkan partikel β berenergi tinggi misalnya P32, Na24 . Sedangkan scintillation counter digunakan untuk mendeteksi isotop yang memancarkan sinar γ B. Teknik fisika untuk pemecahan sel atau isolasi organel molekular Ada 3 tahapan Ekstraksi Sebagai langkah awal dalam pengisolasian organel, molekul, DNA atau organel lainnya. Sebagian besar proses pengisolasian organel dilakukan pada suhu 0-4oC. Atau menggunakan larutan akueosa untuk menghindari kondisi pH dan tekanan osmotik yang ekstrem serta suhu yang tinggi, karena sebagian besar organel atau biomolekul sel bersifat labil dan dan dapat kehilangan aktivitas biologisnya. Larutan yang sering dipakai untuk ekstraksi organel adalah sukrosa 0,25 mol/L, dan pH nya diatur dengan larutan buffer asam klorida TRIS (tris[hidroxymethyl]aminomethane) 0,05 mol/L yang mengandung ion K+ dan Mg2+ (larutan SKTM)

40 2. Homogenasi Untuk mengektrak organel / DNA dari sel pertama tama diperlukan pemecahan sel dalam kondisi ringan melalui proses homogenasi menggunakan alat (pestle) yang digerakan secara manual. Perputaran pestle secara terkontrol akan menghasilkan gaya mekanik merobek pada sel sehingga isi sel akan keluar kedalam larutan sukrosa. Suspensi yang dihasilkan disebut homogenat 3. Sentrifugasi Sentrifugasi digunakan untuk pemisahan sel atau organel subselular juga untuk pemisahan inti sel (DNA) pada tahap molekuler. Subfragsional kandungan homogenat dilakukan dengan sentrifugasi differensial. Setiap sentrifugasi ini akan menghasilkan pellet dan lapisan supernatan. Lapisan supernatan pada masing masing tahap terseut akan disentrifugasi lagi selanjutnya sehingga dihasilkan 3 macam pellet yaitu fraksi nukleus, fraksi mitokhondria dan fraksi mikrosom (mengandung retikulum endoplasma,dan ribosom bebas).

41 Elektroforesis Adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan atas ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan panda suatu medium yang mengandung sample yang akan dipisahkan Teknik ini digunakan untuk analisa : - DNA - RNA - Protein Cara kerja Dalam elektroforesis gel terdapat dua material dasar yang disebut fase diam dan fase bergerak (eluen). Fase diam berfungsi "menyaring" objek yang akan dipisah, sementara fase bergerak berfungsi membawa objek yang akan dipisah. Sering kali ditambahkan larutan penyangga pada fase bergerak untuk menjaga kestabilan objek elektroforesis gel. Elektroda positif dan negatif diletakkan pada masing-masing ujung aparat elektroforesis gel. Zat yang akan dielektroforesis dimuat pada kolom (disebut well) pada sisi elektroda negatif. Apabila aliran listrik diberikan, terjadi aliran elektron dan zat objek akan bergerak ke arah sisi elektroda positif. Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda, tergantung dari muatan dan ukuran objek. Kisi-kisi gel berfungsi sebagai pemisah. Objek berukuran lebih besar akan lebih lambat berpindah.

42 KARAKTERISASI DNA DAN RNA : ELEKTROFORESIS
Untuk mencek apakah proses isolasi DNA atau RNA berhasi mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein Untuk Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA. (mencek produk PCR) Mencek hasil restriksi DNA Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya

43 Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik.  Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode) Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti - ukuran partikel, - komposisi dan konsentrasi gel, - densitas muatan, - kuat medan listrik dan sebagainya.  Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak melalui matriks tersebut

44 GENETIKA MOLEKULAR Genetika molekular merupakan cabang genetika yang mengkaji bahan genetik dan ekspresi genetik di tingkat subselular (di dalam sel). Subjek kajiannya mencakup struktur, fungsi, dan dinamika dari bahan-bahan genetika serta hasil ekspresinya. Ilmu ini mempelajari berbagai aspek yang menyangkut pewarisan sifat dan variasi sifat pada organisme maupun suborganisme (seperti virus dan prion). Ada pula yang dengan singkat mengatakan, genetika adalah ilmu tentang gen. Bidang kajian genetika dimulai dari wilayah molekular hingga populasi (lihat entri biologi). Secara lebih rinci, genetika berusaha menjelaskan 1. material pembawa informasi untuk diwariskan (bahan genetik), 2. bagaimana informasi itu diekspresikan (ekspresi genetik), dan 3. bagaimana informasi itu dipindahkan dari satu individu ke individu yang lain (pewarisan genetik).

45 Perkembangan ilmu Genetika
Dimulai sejak th 1940 ‘Kromosom dlm sel adalah pembawa sifat-sifat keturunan seseorang’ Th 1951 ahli genetika James Watson bersama ahli fisika Francis Crick dan Maurice Wilkins meneliti kromosom ‘Membuat model bentuk molekul DNA’’ hadiah Nobel th 1962 KROMOSOM DAN GEN Kromosom terdapat dalam nukleus (inti sel) Kromosom: jalinan kromatin dlm inti sel yg berupa benang atau batang Jumlah setiap sel sama utk spesies tertentu Jumlah kromosom Manusia 46 (diploid) Manusia berasal dari persatuan antara dua gamet yaitu ovum (sel telur=23) dan spermatozoa =23 (haploid). Individu baru akan mewarisi sifat-sifat orang tuanya. Pembawa unsur-unsur pewarisan yaitu gen Gen-gen itu merupakan rangkaian asam deoksiribonukleat (DNA) dengan panjang tertentu dan merupakan komponen kromosom.

46 Pada setiap tubuh. Materigenetik terletak didalam nukleus, Kecuali untuk sel reproduktif (spermatozoa dan ova) dan sedikit pengecualian lain (Sel darah merah), sel terdiri dari 2 copy dari materi genetik manusia. Inti atau nukleus adalah organel terbesar dalam sel. Memiliki selaput yang terdiri dari dua lapis membran dan di antara kedua membran ada celah Inti berisi cairan yang lebih kental dari pada sitoplasma, disebut nukleoplasma. Dalam nukleoplasma ada benang halus disebut kromatin (kroma = berwarna, tin = benang). KROMATIN adalah materi genetik, atau bahan sifat keturunan. Benang-benang ini dibina atas DNA dan protein. DNA terdiri dari sekitar molekul, tersebar pada benang kromatin. Tiap molekul DNA secara fungsional disebut gen. Gen-lah yang membina unit materi genetis. Gen bekerja menumbuhkan dan memelihara aktivitas sifat keturunan atau karakter. Puluhan ribu jenis karakter dalam tubuh kita. Contoh karakter: bentuk rambut, warna rambut, hormon insulin, hormon pertumbuhan, enzim pencerna protein, enzim pencerna glikogen, antibodi, sel tulang, sel darah, sel saraf, dan sebagainya.

47 Dalam bentuk ketika sel sedang membelah itu kromatin disebut dengan nama kromosom (kromo = berwarna; som atau soma = badan). Barulah dalam bentuk kromosom materi genetik itu tampak jelas di bawah mikroskop cahaya. Dapat dihitung, dapat diamati ujung-pangkalnya, dapat diteliti dengan rinci perilakunya, dan dapat pula dianalisis kemungkinan terjadinya aberasi. Karena dalam bentuk kromosomlah baru dapat dianalisa aberasi pada materi genetik, maka untuk praktisnya benang-benang materi gentik dalam inti sel itu disebut saja kromosom. Dalam tiap sel tiap macam kromosom ada dua atau sepasang. Jumlah kromosom manusia 46, dan menurut macamnya ada 46/2 = 23 pasang. Kromosom yang sepasang atau semacam itu disebut homolog. Homolog dalam panjang dan bentuk, homolog pula kandungan serta letak gen-gennya. Kromosom yang berpasangan pada setiap individu itu yang sebelah diwarisi seseorang dari ibu, lewat sel telur, dan dari ayah lewat sperma. Informasi genetik yang terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup dikemas dalam suatu bentuk materi genetik yang kita kenal sebagai asam deoksiribonukleat (DNA).

48 DNA eukariot dipaket dalam kromosom
Setiap kromosom merupakan molekul DNA tunggal linier yang berasosiasi dengan protein. Total DNA dalam semua kromosom pada suatu organisme disebut genom Setiap kromosom merupakan molekul DNA tunggal linier yang berasosiasi dengan protein. Total DNA dalam semua kromosom pada suatu organisme disebut genom Figure 1-8 Lodish MCB

49 PAKET DNA DALAM KROMOSOM
kromosom yang diperbesar ribuan kali

50 Sintesa Protein Sintesa protein berlangsung dalam ribosom
DNA mengandung informasi untuk mengatur dan membangun tubuh manusia yg kompleks. Akan tetapi bagaimana hasil ini dapat diselesaikan? Dengan membentuk protein Protein sgt diperlukan karena berbagai macam protein struktural dan fungsional ikut mengambil bagian di hampir semua proses dalam sel. Protein struktural terdapat dalam membran, serabut kontraktil dan filamen intrasellular. Protein fungsional seperti enzim sangat dibutuhkan untuk menjadi katalisator

51 Apakah protein itu? Kode genetik
Suatu seri asam amino (aa) Gabungan dari 2 aa di sebut dipeptida Gabungan dari banyak aa disebut polipeptida Polipeptida punya berat molekul : protein Kode genetik Cara untuk menetapkan jumlah serta urutan nukleotida yg berperan dlm menentukan posisi yang tepat dari tiap aa dlm rantai peptida yang bertambah panjang

52 SINTESA PROTEIN Transkripsi dari DNA ke RNA ke protein: Dogma sentra ini sebagmolecular I tulang punggung biologi molekular yang dinamakan sintesa protein . 3 tahap umum sintesa protein Replikasi DNA : DNA mereplikasi bentuknya menjadi berlipat ganda yang melibatkan enzim2x tertentu. 2. Transkripsi . DNA mengkodekan gen ttt untuk menghasilkan RNA messenger (mRNA) Translasi . RNA messenger membawa kode2x genetik ke ribosom . Ribosomes membaca informasi kode genetik ini dan digunakan untuk sintesa protein.

53 SINTESA PROTEIN DNA melalui proses replikasi, setelah DNA pjg bisa digunakan jadi cetakan utk membentuk RNA di nukleus jenis mRNA mRNA mempunyai rantai tunggal keluar melalui membran nukleus masuk ke sitoplasma Didalam mRNA terdpt kodon yg td 3 nukleotida RNA jg terdr tRNA mengandung antikodon utk membawa aa yg ditranslasi/terjemahan dari3 jns kodon menjadi1 jns aa Antikodon ini akan melekat pd kodon yg terdpt di mRNA rRNA tempat membentuk protein, pros pembentukan ini: translasi Proses pembentukan mRNA:translasi Protein yg dibentuk ad gabungan aa yg dibawa tRNA

54 From DNA to Polypeptide
Stop codon Start codon

55

56 Kodon inisiasi AUG yg terjemahannya Metionin
Proses pemanjangan protein ini diteruskan sampai menemui kodon terminasi (3 jenis) Kode genetik dapat dibaca dari frame yang berbeda

57

58

59 Genetics codes Genetics codes

60 Pertumbuhan & perkembangan sel
Berlaku pd makhluk hidup uniseluler maupun multiseluler Pembelahan uniseluler = reproduksi Pembelahan multiseluler = dari muda sampai dewasa Semakin besar ukuran jaringan tubuh makin banyak jumlah sel yg menyusunnya Setelah satu sel mbelah menjadi dua maka masing2 masuk dlm stadium interfase dan kemudian akan mengalami ptumbuhn sel shg menjadi dewasa dan siap untuk membelah kembali Pd dasarnya akan terjadi secara berulang dimana sel muda tumbuh menjadi dewasa. Membelah lagi shg terjadi siklus yg dnamakn siklus sel

61 Siklus sel

62 Tahap perubahan sel scr umum:
Tahap G1 (first gap phase) dimulai dari sel muda yg baru membelah - umumnya membutuhkan waktu 3-4 jam - tahap ini akan terjadi sintesa RNA diikuti sintesa protein yg myebabkn sitoplasma bertambah dan sel akan berkembang Tahap S (Synthetic phase) - terjadi proses sintesis DNA berlangsung 7-8 jam - molekul2 DNA akan terbentuk melalui proses replikasi dari molekul DNA yg sudah ada - terjadi pbentukn molekul histon yg merupakan protein dasar dari kromosom

63 Tahap G2 (second gap phase)
- tahap akhir pertumbuhan sel yg disusul dg pembelahan - umumnya 2-5 jam proses sintesis RNA masih terjadi namun perlahan - sintesa akan berhenti saat pembelahan sel dimulai Sintesa DNA terjadi dalam waktu singkat (tahap S) Sintesa RNA terus terjadi sampai saat sel akan membelah lagi Siklus sel ini akan berjalan terus pada jaringan tubuh yang masih muda melalui tahapan G1, S dan G2

64

65

66

67 Kode genetik yang ada di dalam DNA menentukan bagaimana protein disusun. Sejalan dengan hal tersebut, di bidang biologi molekuler muncul suatu dogma sentral aliran informasi genetik dari DNA ke protein, yang dikemukakan oleh Francis Crick. Menurut dogma tersebut, informasi genetik yang terdapat di dalam DNA akan ditranskripsikan (disalin) ke dalam suatu molekul asam ribonukleat (RNA) dan selanjutnya akan ditranslasikan (diterjemahkan) menjadi protein. Molekul RNA yang dimaksud disebut juga sebagai RNA duta atau messenger RNA (mRNA). Faktor faktor yang menentukan struktur DNA Tumpukan basa Basa purin dan pitidin yang menyusun molekul DNA terletak panda satu bidang datar yang tegak lurus terhadap aksis untaian DNA. Krn itu dianggap sebagai tumpukan basa. Hal ini dapat diketahui dengan - Teknik dispersi rotari optik - Diksroisme sirkular

68 2. Ikatan hidrogen Pada molekul DNA ikatan hidrogen berperan dalam menentukan struktur helix antara untaian yang berpasangan. Pasangaditentukan oleh adanya 2 ikatan hidrogen antara nukelorida A-T , sedangkan G-C terdapat 3 ikatan hidrogen.Oleh karena itu, untuk merusak G-C diperlyukan suhu lebih tinggi dari A-T

69 Ketika seseorang dengan alasan yang sangat beragam dan pribadi ingin tahu akan identitasnya, maka salah satu cara yang dapat dilakukan untuk menyelesaikan masalah tersebut adalah identifikasi DNA (Deoxyribo Nucleic Acid). Identifikasi DNA dapat dimanfaatkan untuk mengetahui hubungan biologis antar individu dalam sebuah keluarga dengan cara membandingkan pola DNA individu-individu tersebut. Lembaga Biologi Molekul Eijkman melalui Yayasan GenNeka menawarkan pelayanan identifikasi DNA, berupa tes paternitas dan tes maternitas. Setiap orang memiliki DNA yang unik. DNA adalah materi genetik yang membawa informasi yang dapat diturunkan. Di dalam sel manusia DNA dapat ditemukan di dalam inti sel dan di dalam mitokondria. Di dalam inti sel, DNA membentuk satu kesatuan untaian yang disebut kromosom. Setiap sel manusia yang normal memiliki 46 kromosom yang terdiri dari 22 pasang kromosom somatik dan 1 pasang kromosom sex (XX atau XY). Identifikasi DNA

70 TES DNA Tes paternitas. Tes paternitas adalah tes DNA untuk menentukan apakah seorang pria adalah ayah biologis dari seorang anak. Kita semua mewarisi DNA (materi genetik) dari orang tua biologis kita. Tes paternitas membandingkan pola DNA anak dengan terduga ayah untuk memeriksa bukti pewarisan DNA yang menunjukkan kepastian adanya hubungan biologis. Tes maternitas. Tes maternitas adalah tes DNA untuk menentukan apakah seorang wanita adalah ibu biologis dari seorang anak. Seperti pada tes paternitas, tes ini membandingkan pola DNA anak dengan terduga ibu untuk menentukan kecocokan DNA anak yang diwariskan dari terduga ibu. Umumnya tes maternitas dilakukan untuk kasus, seperti kasus dugaan tertukarnya bayi, kasus bayi tabung, kasus anak angkat dan lain-lain.

71 Metoda identifikasi DNA yang digunakan dalam tes paternitas dan tes maternitas
Identifikasi DNA untuk tes paternitas dilakukan dengan menganalisa pola DNA menggunakan marka STR (short tandem repeat). STR adalah lokus DNA yang tersusun atas pengulangan 2-6 basa. Dalam genom manusia dapat ditemukan pengulangan basa yang bervariasi jumlah dan jenisnya. Identifikasi DNA dengan penanda STR merupakan salah satu prosedur tes DNA yang sangat sensitif karena penanda STR memiliki tingkat variasi yang tinggi baik antar lokus STR maupun antar individu.

72

73 NUCLEOTIDE SEQUENCING
Restriction endonuclease enzymes Chemical cleavage method Chain termination method RNA sequencing

74 2. a. Enzim Restriksi Endonuklease
adalah enzim-enzim bakteri yang dapat mengenali dan memotong sekuens nukleotida tertentu didalam molekul DNA . - membentuk fragmen DNA yang bervariasi - mampu mengenal sekuens pasangan basa sepanjang 4-8 nukleotida. - ujung hasil potongan dapat berupa : a. Ujung kohesif (sticky) b. Ujung tumpul (blunt)

75

76 DNA SEQUENSING

77 PENYAKIT GENETIK Penyakit adalah keadaan tidak normal pada badan atau minda yang menyebabkan ketidakselesaan, disfungsi, atau tekanan/stres kepada orang yang terbabit atau berhubung rapat dengannya. Kadang kala istilah ini digunakan secara umum untuk menerangkan kecederaan, kecacatan, sindrom, simptom, keserongan tingkah laku, dan variasi biasa sesuatu struktur atau fungsi, sementara dalam konteks lain boleh dianggap sebagai kategori yang boleh dibedakan. Terdapat pelbagai jenis penyakit yang mengancam manusia. Penyakit ini boleh disebabkan oleh kuman, bakteria, virus, racun, kegagalan organ berfungsi, dan juga oleh penyakit keturunan/genetik. Patologi merupakan ilmu kajian penyakit. Pengelasan penyakit secara saintifik pula dirujuk sebagai nosologi.

78 Jenis jenis Penyakit Salah satu kategori penyakit terbesar dan terkenal ialah penyakit berjangki yang' merupakan penyakit yang disebarkan oleh agen jangkitan/vektor seperti bakteria, fungi, parasit, virus, dan prion. Ada juga yang jenis penyakit yang disebarkan oleh protozoa dan cacing. Terdapat juga penyakit genetik yang disebabkan oleh kekurangan, keterlebihan, atau kecacatan gen dalam DNA orang yang terbabit; penyakit toksik disebabkan oleh pendedahan berlebihan kepada toksin alam sekitar seperti logam berat; Penyakit kekurangan(zat) yang disebabkan oleh kekurangan zat dalam makanan tertentu; penyakit autoimun yang disebabkan oleh sistem pertahanan badan menyerang tisu badan sendiri; penyakit yang disebabkan oleh kepercayaan pesakit sendiri; dan penyakit yang menggabungkan jenas-jenis penyakit tersebut, termasuklah yang disebabkan oleh punca yang tidak diketahui.

79 Penyakit genetik atau kelainan genetik adalah sebuah kondisi yang
disebabkan oleh kelainan oleh satu atau lebih gen menyebabkan sebuah kondisi fenotip klinis. Beberapa penyebab penyakit genetik antara lain: - Ketidaknormalan jumlah kromosom seperti dalam sindrom Down (adanya ekstra kromosom 21) dan sindrom Klinefelter (laki-laki dengan 2 kromosom X). - Mutasi gen berulang yang dapat menyebabkan sindrom X rapuh atau penyakit Huntington. - Gen rusak yang diturunkan dari orang tua. Dalam kasus ini, penyakit genetik juga dikenal dengan istilah penyakit keturunan. Kondisi ini terjadi ketika individu lahir dari dua individu sehat pembawa gen rusak tersebut, tetapi dapat juga terjadi ketika gen yang rusak tersebut merupakan gen yang dominan. Sekarang ini ada sekitar penyakit genetik yang sudah diidentifikasi. Kebanyakan penyakit genetik adalah langka dengan hanya terjadi pada 1 individu dari sekitar ribuan atau bahkan jutaan individu.

80 Contoh contoh penyakit genetik
1. Penyakit Porphyria Porphyria berasal dari perkataan perkataan Yunani yang membawa erti "warna ungu". Ini adalah merujuk kepada warna air kencing pesakit porphyria yang mengandungi pewarna menyebabkan warna merah sehingga kepada biru gelap. Porphyria bukannya satu penyakit yang berjangkit tetapi merupakan penyakit genetik yang boleh diwarisi. Porphyrin merupakan pewarna yang berfungsi sebagai pengangkut tenaga dalam sistem badan dan juga terlibat dalam pembentukan komponen hemoglobin bagi mengangkut oksijen, yang dikenali sebagai hema, dalam darah. Bagi manusia sihat sistem ini berfungi dengan baik tetapi bagi sesetengah orang, salah satu daripada enzim yang terbabit dalam penghasilan molekul hema adalah cacat atau pincang. Ini menyebabkan molekul hema yang tidak sempurna terkumpul dalam badan pesakit Porphyria. Molekul porphyrin dan precursory memasuki saluran darah dan akan disingkirkan keluar badan oleh ginjal melalui air kencing. Akhirnya sel yang menghasilkan hema gagal berfungsi dan menyebabkan simptom porphyria.

81 Tanda-tanda pesakit porphyria
Pengidap porphyria biasanya melapurkan sakit dibahagian perut secara berulang selama beberapa tahun. Mereka juga menjadi keliru dan sering menyangka orang lain cuba mencederakan mereka. Pesakit porphyria juga akan mempunyai air kencing yang bewarna kemerahan sehingga kepada biru gelap. Pengidap porphyria sering didapati dikalangan mereka yang berasal dari Afrika Selatan. Organ yang terbabit oleh porphyria adalah sistem saraf dan kulit. Kulit pesakit porphyria tidak boleh terdedah kepada cahaya matahari. Ini adalah kerana ketiadaan pewarna kulit akan menyebabkan kulit pesakit porphyria akan terbakar yang teruk oleh cahaya matahari. Pembabitan sistem saraf bertanggung jawab menyebabkan perubahan deria sentuh, lumpuh, gila pada pesakit porphyria. Sakit pada bahagian perut pesakit porphyria bukanlah disebabkan oleh kecederaan organ dalam perut tetapi disebabkan neuron yang teraktif, dengan itu mengaktifkan deria penerima sakit yang menyaluti rongga perut. Pengesanan pesakit porphyria. Pengidap porphyria boleh dikesan dengan ujian 5-Asid Aminolevulinic (ALA), dan porphobilinogen. Pengidap porphyria boleh mengawal keadaan mereka dengan menjaga permakanan mereka. Bagaimanapun, terdapat pelbagai jenis porphyria, dan jenis rawatan bergantung kepada jenis porphyria yang dihidapi pesakit

82 2. Talasemia Merupakan salah satu jenis anemia hemolitik dan merupakan penyakit keturunan yang diturunkan secara autosomal yang paling banyak dijumpai di Indonesia dan Italia. Enam sampai sepuluh dari setiap 100 orang Indonesia membawa gen penyakit ini. Kalau sepasang dari mereka menikah, kemungkinan untuk mempunyai anak penderita talasemia berat adalah 25%. Klasifikasi talasemia Talasemia dapat kita klasifikasikan berdasarkan jenis rantai globin apa yang terganggu. Berdasarkan dasar klasifikasi tersebut, maka terdapat beberapa jenis talasemia, yaitu talasemia alfa, beta, dan delta. 1. Talasemia alfa Pada talasemia alfa, terjadi penurunan sintesis dari rantai alfa globulin. Dan kelainan ini berkaitan dengan delesi pada kromosom 16. Akibat dari kurangnya sintesis rantai alfa, maka akan banyak terdapat rantai beta dan gamma yang tidak berpasangan dengan rantai alfa. Maka dapat terbentuk tetramer dari rantai beta yang disebut HbH dan tetramer dari rantai gamma yang disebut Hb Barts. Talasemia alfa sendiri memiliki beberapa jenis.

83 - Delesi pada empat rantai alfa
Dikenal juga sebagai hydrops fetalis. Biasanya terdapat banyak Hb Barts. Gejalanya dapat berupa ikterus, pembesaran hepar dan spleen, dan janin yang sangat anemis. Biasanya, bayi yang mengalami kelainan ini akan mati beberapa jam setelah kelahirannya atau dapat juga janin mati dalam kandungan pada minggu ke Bila dilakukan pemeriksaan seperti dengan elektroforesis didapatkan kadar Hb adalah 80-90% Hb Barts, tidak ada HbA maupun HbF - Delesi pada tiga rantai alfa Dikenal juga sebagai HbH disease biasa disertai dengan anemia hipokromik mikrositer. Dengan banyak terbentuk HbH, maka HbH dapat mengalami presipitasi dalam eritrosit sehingga dengan mudah eritrosit dapat dihancurkan. Jika dilakukan pemeriksaan mikroskopis dapat dijumpai adanya Heinz Bodies. - Delesi pada dua rantai alfa Juga dijumpai adanya anemia hipokromik mikrositer yang ringan. Terjadi penurunan dari HbA2 dan peningkatan dari HbH - Delesi pada satu rantai alfa Disebut sebagai silent carrier karena tiga lokus globin yang ada masih bisa menjalankan fungsi normal.

84 2. Talasemia beta Disebabkan karena penurunan sintesis rantai beta. Dapat dibagi berdasarkan tingkat keparahannya, yaitu Ttalasemia mayor, intermedia, dan karier. Pada kasus talasemia mayor Hb sama sekali tidak diproduksi. Akibatnya, penderita akan mengalami anemia berat. Jika tidak diobati, bentuk tulang wajah berubah dan warna kulit menjadi hitam. Selama hidupnya penderita akan tergantung pada transfusi darah. Ini dapat berakibat fatal, karena efek sampingan transfusi darah terus menerus yang berupa kelebihan zat besi (Fe). 3. Talasemia delta Uji talasemia pra-kelahiran Wanita hamil yang mempunyai resiko mengandung bayi talasemia dapat melakukan uji untuk melihat apakan bayinya akan mederita talasemia atau tidak. Di Indonesia, uji ini dapat dilakukan di Yayasan Geneka Lembaga Eijkman di Jakarta. Uji ini melihat komposisi gen-gen yang mengkode Hb.

85 3. Fenilketonuria Fenilketonuria adalah penyakit metabolik bawaan yang disebabkan kurangnya enzim fenilalanin hidroksilase. Dalam fungsinya sehari-hari, enzim fenilalanin hidroksilase akan mengubah asam amino fenilalanin menjadi tirosin. Bila enzim tersebut tidak ada atau tidak berfungsi, tentu saja reaksi perubahan tersebut tidak akan terjadi. Akibatnya, kadar fenilalanin dalam tubuh akan meningkat jauh di atas normal, dan kadar tirosin tentunya menjadi di bawah normal. Kadar fenilalanin yang tinggi inilah yang menjadi biang keladi persoalan sehingga aspartam harus menanggung beban tanda peringatan. Kadar fenilalanin yang tinggi dalam darah dapat membahayakan perkembangan otak anak. Akibatnya, anak dapat mengalami retardasi mental. Memang sejarah penemuan fenilketonuria pun diawali dengan penelitian pada anak yang mengalami retardasi mental tersebut. Gejala klinis Retardasi mental merupakan keadaan yang dapat dijumpai pada penderita fenilketonuria. Selain itu, keringat dan urin penderita berbau khas keton. Kelebihan fenilalanin memang diubah menjadi fenilketon, dan dikeluarkan melalui urin. Dari sinilah istilah fenilketonuria muncul. Penderita fenilketonuria juga cenderung bermata biru dan berambut pirang. Hal ini disebabkan oleh rendahnya kadar tirosin darah yang mengakibatkan menurunnya produksi dari pigmen melanin.

86 4. Anemia Anemia (dalam bahasa Yunani: Tanpa darah) adalah keadaan dimana jumlah sel darah merah atau jumlah hemoglobin (protein pembawa oksigen) dalam sel darah merah berada dibawah normal. Sel darah merah mengandung hemoglobin, yang memungkinkan mereka mengangkut oksigen dari paru-paru dan mengantarkannya ke seluruh bagian tubuh. Anemia menyebabkan berkurangnya jumlah sel darah merah atau jumlah hemoglobin dalam sel darah merah, sehingga darah tidak dapat mengangkut oksigen dalam jumlah sesuai yang diperlukan tubuh. Anemia Sel Sabit (Sickle cell anemia)‏ Disebut juga anemia drepanositik, meniskositosis, penyakit hemoglobin S. Anemia sel sabit adalah sejenis anemia kongenital dimana banyak sel darah merah berbentuk menyerupai sabit. Patogenesis Adanya HbS (hemoglobin S (sicle= sabit) merupakan hemoglobin abnormal. )mempengaruhi membran eritrosit dan menyebabkan kelainan eritrosit, yakni dehidrasi karena kehilangan air dan garam, akumulasi Ca ++. Belum diketahui dengan jelas apa kelainan dasar pembentukan sel sabit ,yang kadang kala bentuk sabit yang ireversible.

87 Bentuk sel sabit terjadi pada tekanan oksigen yang rendah dan terutama pada pH rendah, Hb S kurang melarut pada bentuk deoxygenated sehingga viskositas darah naik dan mengakibatkan statis serta obstruksi aliran darah dalam sistem kapiler, arteriole terminal dan pembuluh darah. Sickling lokal, oklusi vaskular dan edema perivaskular menyebabkan rasa sakit dan pembengkakan organ yang tersangkut. Gejala klinis Kebanyakan anemia sel sabit disertai anemia yang agak berat. Namun pada umumnya anemia tidak merupakan masalah utama karena suplai oksigen kejaringan tetap baik. Komplikasi Infeksi sering terjadi dan bisa fatal pada masa anak-anak. Pada orang dewasa menurunnya faal paru dan ginjal dapat berlangsung progresif. Kolelitiasis sering dijumpai dan infark ,tulang nekrosis, aseptik pakut fermoralis, osteomielitis (infeksi salmonella), hematuria berat sering berulang-ulang. Penentuan diagnosis Homosigot : Hb S dengan Hb F dengan kadar yang berbeda-beda pada pemeriksaan elektroforesis. Heterosigot : adanya Hb A dan HbS pada elektroforesis

88 5. Anemia Akibat Kanker Penderita kanker stadium lanjut sering menderita komplikasi anemia. Anemia umumnya timbul akibat progresifitas penyakit kankernya sendiri maupun kemoterapi, radioterapi dll, yang dapat memperburuk kondisi penderita secara cepat. Anemia kronik pada penyakit kanker disebabkan oleh beberapa mekanisme patofisiologik. Patogenesis anemia karena kanker adalah multifaktorir. Dan sulit di identifikasi satu faktor penyebab saja. Ciri khas anemia akibat kanker Anemia ringan sampai berat Anemia normositik ,normokrom atau hipokrom Kadar besi serum (serum iron) rendah Kadar feritin serum meningkat Kadar transferin total menurun Prosentase saturasi transferin normal Patofisiologi anemia kronik pada kanker Terjadinya interaksi antara sel-sel tumor dan sistem imun yang mana akan mengaktifkan makrofag dan memicu pelepasan berbagai sitokin. Aktivasi ini menyebabkan terjadinya peningkatan kadar sitokin inflamasi seperti: interferon g , interleukin -1, faktor nekrosis tumor (TNF).

89 Sitokin-sitokin ini diproduksi oleh makrofag dan sel retikuloendotelial lainya (al. TNF & INF b diproduksi di stroma sumsum tulang). Sitokin-sitokin ini mempunyai pengaruh negatif terhadap prekursor eritroid di sumsum tulang yaitu: menyebabkan kaheksia, anemia dan inflamasi. Dan juga menurunkan produksi dan sensitivitas Epo terhadap keadaan anemia. Penghambatan diferensiasi prekursor eritroid oleh sebagian besar sitokin inflamasi, mengakibatkan menurunnya jumlah sel progenitor eritroid menyebabkan supresi eritropoesis, stimulasi produksi eritropoetin (EPO) menurun dan mengakibatkan kegagalan penggunaan besi. Faktor-faktor ini diperkirakan merupakan penyebab utama terjadinya anemia kronik & mungkin masih ada faktor lain sebagai pemicu yang belum diketahui dengan pasti. Dan hal ini pula yang menyebabkan usia sel darah merah memendek pada anemia penderita kanker . 6. Hemofilia Hemofilia adalah kelainan perdarahan yang diturunkan yang disebabkan adanya kekurangan faktor pembekuan. hemofilia A timbul jika ada defek gen yang menyebabkan kurangnya faktor pembekuan VIII (FVII) sedangkan hemofilia B disebabkan kurangnya faktor pembekuan IX (FIX). hemofilia A dan B tidak dibedakan karena mempunyai tampilan klinis yang mirip dan pola pewarisan gen yang serupa. hemofilia adalah salah satu penyakit genetik tertua yang pernah dicatat. kelainan perdarahan yang diturunkan yang terjadi pada seorang laki-laki tercatat dalam berkas Talmud pada Abad Kedua. sejarah modern dari hemofilia dimulai pada tahun 1803 oleh John Otto yang menerangkan adanya anak yang menderita hemofilia, diikuti oleh Nasse pada tahun 1820 yang pertamakali mereview hemofilia.

90 Hemofilia merupakan salah satu penderita penyakit yg dapat mematikan,jika ia terluka maka darah tidak dapat terhenti,dikarnakan memiliki hemoglobin yg berlebihan,jika ia wanita kemungkinan terjadi kematian disaat pertama kali menstruasi, dan jika laki2 pada saat di khitankan. Hemofilia A dan B Hemofilia terbagi atas dua jenis, yaitu : - Hemofilia A; yang dikenal juga dengan nama : - Hemofilia Klasik; karena jenis hemofilia ini adalah yang paling banyak kekurangan faktor pembekuan pada darah. - Hemofilia kekurangan Factor VIII; terjadi karena kekurangan faktor 8 (Factor VIII) protein pada darah yang menyebabkan masalah pada proses pembekuan darah. - Hemofilia B; yang dikenal juga dengan nama : - Christmas Disease; karena di temukan untuk pertama kalinya pada seorang bernama Steven Christmas asal Kanada - Hemofilia kekurangan Factor IX; terjadi karena kekurangan faktor 9 (Factor IX) protein pada darah yang menyebabkan masalah pada proses pembekuan darah.

91 Bagaimana ganguan pembekuan darah itu dapat terjadi?
Gangguan itu dapat terjadi karena jumlah pembeku darah jenis tertentu kurang dari jumlah normal, bahkan hampir tidak ada. Perbedaan proses pembekuan darah yang terjadi antara orang normal dengan penderita hemofilia, menunjukkan pembuluh darah yang terluka di dalam darah tersebut terdapat faktor-faktor pembeku yaitu zat yang berperan dalam menghentukan perdarahan. a. Ketika mengalami perdarahan berarti terjadi luka pada pembuluh darah (yaitu saluran tempat darah mengalir keseluruh tubuh), lalu darah keluar dari pembuluh. b. Pembuluh darah mengerut/ mengecil. c. Keping darah (trombosit) akan menutup luka pada pembuluh. d. Faktor-faktor pembeku da-rah bekerja membuat anyaman (benang - benang fibrin) yang akan menutup luka sehingga darah berhenti mengalir keluar pembuluh. 7. Limfoma Hodgkin Limfoma Hodgkin, juga diketahui sebagai penyakit Hodgkin, adalah tipe limfoma yang pertama kali dideskripsikan oleh Thomas Hodgkin tahun Secara klinis, Limfoma Hodgkin dikarakterisasikan dengan penyebaran penyakit melalui satu grup nodus limfa menuju lainnya dan dengan perkembangan gejala B dengan penyakit yang sudah jauh berkembang.

92 Secara pathologi, penyakit ini dikarakterisasikan oelh kehadiran sel Reed-Sternberg. Limfoma Hodgkin adalah salah satu dari kanker pertama yang dapat disembuhkan oleh radiasi. Nantinya limfoma Hodgkin merupakan salah satu yang pertama kalinya dapat disebuhkan oleh kombinasi kemoterapi. Rata penyembuhan sekitar 93%, membuat penyakit ini sebagai salah satu kanker yang paling dapat disembuhkan. 8. Kanker Kanker adalah segolongan penyakit yang ditandai dengan pembelahan sel yang tidak terkendali dan kemampuan sel-sel tersebut untuk menyerang jaringan biologis lainnya, baik dengan pertumbuhan langsung di jaringan yang bersebelahan (invasi) atau dengan migrasi sel ke tempat yang jauh (metastasis). Pertumbuhan yang tidak terkendali tersebut disebabkan kerusakan DNA, menyebabkan mutasi di gen vital yang mengontrol pembelahan sel. Beberapa buah mutasi mungkin dibutuhkan untuk mengubah sel normal menjadi sel kanker. Mutasi-mutasi tersebut sering diakibatkan agen kimia maupun fisik yang disebut karsinogen. Mutasi dapat terjadi secara spontan (diperoleh) ataupun diwariskan (mutasi germline).

93 Kanker dapat menyebabkan banyak gejala yang berbeda, bergantung pada lokasinya dan karakter dari keganasan dan apakah ada metastasis. Sebuah diagnosis yang menentukan biasanya membutuhkan pemeriksaan mikroskopik jaringan yang diperoleh dengan biopsi. Setelah didiagnosis, kanker biasanya dirawat dengan operasi, kemoterapi dan/atau radiasi. Bila tak terawat, kebanyakan kanker menyebabkan kematian; kanker adalah salah satu penyebab utama kematian di negara berkembang. Kebanyakan kanker dapat dirawat dan banyak disembuhkan, terutama bila perawatan dimulai sejak awal. Banyak bentuk kanker berhubungan dengan faktor lingkungan yang sebenarnya bisa dihindari. Merokok tembakau dapat menyebabkan banyak kanker dari faktor lingkungan lainnya. Tumor (bahasa Latin; pembengkakan) menunjuk massa jaringan yang tidak normal, tetapi dapat berupa "ganas" (bersifat kanker) atau "jinak" (tidak bersifat kanker). Hanya tumor ganas yang mampu menyerang jaringan lainnya ataupun bermetastasis. Ketika sel normal (A) rusak atau tua (2), mereka mengalami apoptosis (1); sel kanker (B) menghindari apoptosis dan terus membelah diri

94 9. Sindrom Leigh Sindrom Leigh merupakan sejenis penyakit genetik neurometabolik yang jarang ditemui di mana berlaku proses degenerasi/kemerosotan pada sistem saraf utama iaitu otak, saraf tunjang dan saraf mata. Ini bermaksud sistem saraf utama akan hilang keupayaan berfungsi dan proses ini berlaku secara beransur-ansur. Ia mula diketengahkan pada tahun 1951 dan Sindrom Leigh Penyakit ini menjadi ketara dengan cepat dengan tanda-tanda pertamanya adalah seperti hilang kawalan pada leher dan kepala, kurang menghisap susu, hilang kawalan pada otot-otot, hilang selera makan, muntah-muntah, sawan dan menangis berpanjangan adalah mungkin tanda-tanda lain yang turut dilihat dalam penyakit ini.Semasa penyakit ini berlarutan dan menjadi lebih serius, masalah-masalah lain seperti masalah jantung dan lemah keseluruhan otot-otot badan berlaku mengakibatkan lactic acidosis iaitu keadaan di mana badan menghasilkan terlampau banyak asid laktik. Sindrom Leigh adalah suatu masalah genetik pada enzim-enzim atau bahan-bahan kimia dalam badan yang mengawal beberapa proses biokimia yang perlu untuk kehidupan. Tanda-tanda Lewat perkembangan, lemah otot dan lactic acidosis berlaku hampir-hampir pada semua kes Sindrom Leigh.

95 Dimana informasi tsb didapat?
PERKEMBANGAN BIOLOGI MOLEKULAR Sel tubuh manusia Tubuh manusia dibangun lenih kurang 3x1013 cells Perintah semua informasi yang diperlukan makhluk hidup berada di materi genetik yang dijumapi pada setiap sel. Setiap sel mengandung keseluruhan genom manusia. Dimana informasi tsb didapat? As example, the human body consists of approx. 3x 1013 cells. The instructions providing all information necessary for the living organism resides in the genetic material, which will be found in each individual cell. Each cell contains all the information, that makes an human being. So to say, the complete human genome is found in each single cell. Materi genetik : DNA Unit dari muolekul genetik yang mengkodekan informasi : gen. Unit penyimpanan materi genetik dipaket dengan nama kromosom. Manusia terdiri dari 46 kromosom Dijumpai di nukleus sel

96 Informasi genetik diterjemahkan dari DNA ke protein.
Dari gen ke protein Gen merupakan instruksi manual untuk tubuh manusia. Yang terdiri dari perintah untuk membangun semua protein --- tubuh dapar berfungsi. Informasi genetik diterjemahkan dari DNA ke protein. The genes are the instruction manuals for the bodies, their specific compartments and functions. The Information in the genes helps to make cells working in the correct way: a cell in the muscle has different function than a cell in the brain. Only the actively needed information in a certain cell is specifically translated into proteins. Cell Chromosomes Gene DNA Protein

97 (DNA) Truktur DNA dianalisa oleh James Watson & Francis Crick in 1953
DNA adalah sebuah polimer pembangun unit nya terdiri dari pospat, deoxyribosa dan basa nitrogen are attached. Two strands form a double helix (DNA) DNA Sugar Bases Phospate Nucleotide In 1953 James Watson and Francis Crick described the structure of DNA. For this analysis they awarded the Nobel price. The DNA consists out of nucleotides, a nitrogenous base attached to a pentose sugar and phosphates backbone. The structure of a DNA looks like a simple ladder, which is wound up.

98 DNA and Base Complementarity
Cytosine (C) Adenine (A) Guanine (G) Guanine (G) Thymine (T) Thymine (T) Guanine (G) Adenine (A) The nitrogenous bases can form complementary pairs, thymine binding with adenine and cytosine with guanine. Hydrogen bonds form between the complementary bases binding them together. The triple bond between cytosine (C) and guanine (G) is stronger than the double bond between thymine (T) and adenine (A). These bonds hold together complementary strands of DNA forming double-stranded molecules. Cytosine (C) Adenine (A)

99 DNA mengandung informasi
The human genome contains 3x109 base pairs Assuming that 3000 bases would fit on one page, 1000 books with 1000 pages each are necessary to comprise the human genome information of 3x109 letters. If you would compare the human genome with a library where books are found with 3000 letters on each side, you would need 1000 books containing 1000 pages to represent the information.

100 PCR Technology PCR = Polymerase Chain Reaction
Enzyme based site directed amplification of nucleic acids Developed by Kary Mullis (USA) in 1985 Awareded with the Nobel-price Kegunaan utama dari PCR adalah untuk menggandakan sebuah bagian spesifik dari DNA (misal sebuah gen) hingga berkali² lipat (amplifikasi) sehingga bagian spesifik DNA yang kita inginkan dapat kita identifikasi dan diketahui keberadaannya. The Polymerase chain reaction is an enzyme based site directed amplification of nucleic acid. This technology was developed by Karry Mullis in 1985 and awarded with the Nobel-price.

101 Apakah Metoda PCR ? Metoda PCR adalah paten teknologi yang dapat membuat tiruan berlipat ganda dari sekuen nukleotida spesifik dari organisme target. Metoda PCR menyediakan suatu mekanisme untuk mendeteksi target organisme dengan konsentrasi yang sangat kecil dengan spesifitas yang tinggi.

102 PCR : proses amplifikasi
Tahapan Proses PCR Pre – PCR : Preparasi reagensia Preparasi spesimen : isolasi/ purifikasi DNA/ RNA PCR : proses amplifikasi Denaturasi (pemisahan rantai DNA) Annealing (penempelan primer) Extension (pemanjangan oleh enzim) Post – PCR : Deteksi/ Analisa Hasil PCR

103 PRE-PCR Preparasi spesimen : isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat
Isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat dilakukan karena DNA/RNA merupakan bahan dasar berbagai teknik molekular biologi. Ekstraksi DNA/RNA dari organisme eukariotik (manusia, hewan, tumbuhan) dilakukan melalui proses : Penghancuran dinding sel Penghilangan komponen seluler seperti protein, lipid dan karbohidrat dari sampel Pengendapan DNA/RNA Pemanenan

104 Preparasi spesimen : isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat dengan Metode Phenol
Isolasi DNA Isolasi RNA

105 Berikatan dengan “glass fleece” Garam kaotropik Wash and spin
Preparasi spesimen : isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat dengan Metode Kolom Berikatan dengan “glass fleece” Garam kaotropik Wash and spin Pelarutan asam nukleat Analisa selanjutnya All High Pure kits have the same principle in common. You know one, you know all of them. Based on the properties of nucleic acids to adsorb to silica or glass surfaces in the presence of high concentrations of a chaotropic salt (e.g. guanidine salts, Na-perchlorate, Na-iodide,…..). Hydrate shell of NA is disturbed, thus entropy driven reaction to interact with SiO2 moieties of glass. Alcohol in wash buffer keeps NA adsorbed. With aqueous elution buffer the interaction is reversed. NA can directly be used for enzymatic reactions.

106 Sekuen Target DNA/ RNA diperoleh dari hasil isolasi/ purifikasi target organisme Target Sequence DNA Strand Double Helix DNA Strand Supercoiled DNA Strand Chromosome

107 Sekuen Nukleotida Hydrogen Bonds Cytosine (C) Adenine (A) Guanine (G)
Thymine (T) Thymine (T) Guanine (G) Adenine (A) Cytosine (C) Deoxyribose (Sugar molecule) Phosphoric Acid (Phosphate molecule)

108 Pre-PCR Preparasi Reagensia : Komponen Master Mix
Mg2+ and OR Taq DNA Polymerase Mn2+ rTth DNA Polymerase dCTP AmpErase® dGTP dUTP Biotinylated Primer dATP

109 Polymerase Chain Reaction
Target DNA/RNA Mg2+ PCR AmpErase® Taq DNA Polymerase Biotinylated Primers dUTP dCTP dGTP Biotinylated Amplicon Biotinylated Amplicon dTTP dATP Master Mix

110 Yang diperlukan pada PCR
PCR is performed in very small dimensions. In general, 20µl reaction volume is sufficient. The components of the reaction mixture are DNA, a specific enzyme, derived from heat-resistant bacteria, artificial PCR-primers, the letters of the genetic code called nucleotides and buffer conditions, allowing the reaction to take place. The process itself requires several temperature steps. Nowadays, thermal cyclers are available, which perform the heating and cooling of the reaction mix automatically. In the following pages the thermal core process and the subsequent PCR reaction is explained.

111 PROSES PCR : Amplifikasi 1 – Denaturasi oleh panas
Target Sequence Target Sequence

112 2 – Annealing Penempelan pasangan primer berlabel biotin di kedua ujung Sekuen Target
Target Sequence 3’ 5’ 5’ 3’ Biotin Primer 1 Primer 2 Biotin 3’ 5’ 5’ 3’ Target Sequence

113 3 – Ekstension Taq DNA Polymerase mengkatalisa pemanjangan Primer sebagai Komplemen Nukleotida
Target Sequence 3’ 5’ 5’ 3’ Biotin Primer 1 Taq DNA Polymerase Primer 2 Biotin 3’ 5’ 5’ 3’ Target Sequence

114 Akhir Siklus PCR ke-1 Hasil 2 tiruan dari Sekuen Target
Target Sequence Biotin Biotin Target Sequence

115 Target Amplifikasi : Siklus PCR diulang
No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target ,048,576 ,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon

116

117 Deteksi/ Analisa Hasil PCR
Elektroforesis gel agarosa (horizontal) Eleftroforesis gel poliakrilamid (vertikal) Enzym labelling oligonucleotide Biotin-labelled oligonucleotide Digoxigenin-labelled oligonucleotide Sequencing

118 Deteksi Produk PCR: Elektroforesis Gel agarosa

119 Applikasi PCR 1. Isolation of genomic DNA PCR memungkinkan pengisolasian fragmen DNA dari DNA genomic secara amplifikasi selektif dari area DNA spesifik. 2. Pengunaan PCR meningkatkan beberapa metoda seperti Southern and northern blotting dan DNA cloning, yang membutuhkan sejumlah banyak DNA yang melambangkan are DNA spesific. 3 Aplikasi lain PCR termasuk DNA sequencing untuk menetukan urutan dari DNA yang sudah diamplifikasi. 4. Isolasi dari urutan DNA memungkinakan tehnologi baru yaitu DNA rekombiann. 5. DNA rekombinan yaitu menyisipkan suatu urutan DNA kedalam plasmid atau materi genetik pada organisme lain. 6. PCR juga digunakan untuk penetuan sidik jari pada bidang forensik untuk mengindentifikasi orang atau organisme dan membandingkannya dengan peta DNA.

120 Aplikasi dan perkembangan molekuler
Aplikasi bioteknologi modern adalah bioteknologi biomolekuler yang telah memanfaatkan pengetahuan genetika dan kloning, atau secara umum disebut rekayasa genetika, seperti : 1. Mutasi buatan : yaitu mutasi yang ditujukan untuk merubah susunan gen, sehingga sifat yang diturunkan pun berubah. Mutasi buatan ini umumnya menggunakan radiasi, contohnya : padi var. Atomita I dan II, kedelai var. Muna. 2. Transplantasi gen / Penyisipan gen / Teknologi Plasmid: yaitu penyisipan gen organisme satu ke genom organisme lain, dengan tujuan untuk produksi suatu senyawa dalam skala besar dan cepat, untuk terapi medis, atau untuk mengatasi masalah lingkungan. 3. Hibridoma : yaitu teknik pencangkokan sel dengan materi genetik dari sel yang lain, yang umumnya digunakan untuk terapi medis kekebalan tubuh (imunoterapi) dan kanker. Contohnya pemasukkan genom penghasil antibodi dari sel limfosit, kedalam sel kanker yang sangat cepat berploriferasi, sehingga sel kanker tersebut dapat menghasilkan antibodi dan dapat melawan sel kanker lainnya atau zat asing yang masuk ke dalam tubuh dengan cepat, yang secara normal tidak bisa diatasi oleh antibodi dari sel limfosit saja. 4. Kloning : yaitu teknik perbanyakan sel, jaringan atau organisme secara aseksual, bias melibatkan dua induk atau satu induk.

121 Adapun teknik rekayasa genetika yang umum dilakukan adalah sebagai berikut :
A. Perbanyakan (Pengklonan) DNA Kloning DNA umumnya adalah perbanyakan DNA rekombinan, yaitu DNA yang sudah direkayasa dengan teknik penggabungan/penyisipan gen (DNA) dari organisme satu ke dalam genom organisme lain (transplantasi gen/teknologi plasmid). Contohnya : kloning gen penghasil insulin dari kelenjar pankreas manusia, disisipkan ke dalam plasmid bakteri Escherichia coli, sehingga bakteri dapat mengekspresikan gen tersebut dan menghasilkan insulin manusia dalam jumlah yang banyak, mengingat bakteri sangat cepat membelah diri dan bertambah banyak dengan cepat. Mekanisme Penyisipan Gen/DNA : 1. DNA yang ingin disisipkan, diisolasi dan dipotong oleh enzim endonuklease restriksi, ditempat yang urutan nukleotidanya spesifik. 2. DNA yang akan digunakan sebagai inang, misalnya plasmid bakteri E. coli, diisolasi dan dipotong pula oleh enzim yang sama. Plasmid ini biasanya disebut sebagai vektor pengklon. 3. Fragmen DNA kemudian disisipkan ke dalam vektor dan disatukan oleh enzim endonuklease ligase. 4. Plasmid yang telah disisipi, dimasukkan kembali ke dalam bakteri, kemudian bakteri tersebut dikembangbiakan menjadi banyak, sehingga rekombinan pun ikut bertambah banyak, demikian pula hasil ekspresi gennya (Gambar 1).

122 B. Kloning Gen Eukariotik dalam Plasmid Bakteri
Pengekspresian gen eukariot di dalam ruang lingkup gen prokariot sangatlah sulit, karena kedua gen tersebut susunannya berbeda, selain itu adanya daerah bukan pengkode (intron) di dalam DNA eukariotik yang cukup panjang, dapat mencegah ekspresi gen yang benar oleh sel prokariot.Untuk mengatasi hal tersebut, maka ketika enzim restriksi memotong DNA eukariot, dibagian hulu fragmen DNA tersebut harus disisipi oleh promoter prokariot. Pada saat gen eukariot disisipkan, bakteri dapat mengenali promoter, dan langsung mengekspresikan gen tersebut. Untuk hal yang kedua, bisa diatasi dengan merubah mRNA menjadi DNA komplementer (‘complementary DNA’/cDNA), menggunakan enzim transkriptase balik (‘reverse transcriptase’), yaitu enzim yang diisolasi dari retrovirus. mRNA bisa digunakan karena pada mRNA, intronnya telah dikeluarkan pada saat proses ‘splicing’ . Setelah DNA ditransplantasi menghasilkan DNA rekombinan, maka DNA tersebut harus dimasukkan kembali ke dalam inang, supaya bisa berekspresi. Pemasukkan DNA rekombinan bisa dengan cara elektroporasi (memberikan kejutan listrik untuk membuka membran sel), atau dengan cara penyuntikan (mikroinjeksi), atau dengan cara transformasi, yaitu penyerapan DNA rekombinan dari larutan.

123 C. Kloning DNA secara In Vitro
Pengklonan DNA di dalam sel tetap merupakan metode terbaik untuk mempersiapkan gen tertentu dalam jumlah banyak. Namun ketika sumber DNA sangat sedikit dan tidak murni, maka dapat digunakan metode PCR (‘Polymerase Chain Reaction’), sehingga setiap fragmen DNA dapat disalin beberapa kali dengan cepat dan diperkuat (amflipikasi) tanpa menggunakan sel. Mekanisme PCR dapat dilihat pada gambar 3. Adapun yang dibutuhkan dalam PCR ini adalah enzim DNA polimerase yang tahan panas, potongan DNA untai tunggal sebagai primer, dan pasokan nukleotida. Sejak tahun 1985, PCR telah banyak digunakan dalam penelitian biologis kedokteran, sosial, dan hukum. Contohnya : PCR digunakan untuk memperkuat DNA gajah purba (Mamoth), yang telah berusia tahun, PCR digunakan untuk mendeteksi pelaku kejahatan dari sampel DNA air mani, darah atau jaringan tubuh pelaku lainnya, atau PCR ini digunakan untuk mendeteksi patogen yang sulit terdeteksi, seperti DNA virus HIV.