KONSTRUKSI PLASMID REKOMBINAN pQE30+CP[ToCV] UNTUK EKSPRESI PROTEIN CP

Presentasi berjudul: "KONSTRUKSI PLASMID REKOMBINAN pQE30+CP[ToCV] UNTUK EKSPRESI PROTEIN CP"— Transcript presentasi:

1 KONSTRUKSI PLASMID REKOMBINAN pQE30+CP[ToCV] UNTUK EKSPRESI PROTEIN CP
atggagaaccgtgctgttccaaacactggtgataatggtggtcgccgcaatcctctggttagaccgttagatgattgcgtagatgacgaggtgcagaacttgggcaggagggacgatccaacatctatcattccggctaatcctaatcgatcttccagttgggctttgttgaacccggatactattaattataacgagttaaggaaattgaaggtacactccactaggggtgatactcttaccttgactcaggaagaggagttcgagaagatactcgaatccttctgcaggcgaataatcggtgagacccagatgacggataagattttcgctggtttctacatgtctatgtgtcaggccattgtaaaccaagggacctcagttaaagcagccggtaataacagtcttgaaaattactttgaggtagatggcgcgagatttaagtgcaaaactccggatttgataaatgaggttagacccaaaatggccgatgttccaaacgctatacgtcggtacgccaggagtcatgaaaagattattcaggactttatcaactccggtcttataaagcctgattatcatttacaattcaaacatggcgtattaccaagccatgtgtttggtaccggcgattatataaatggttcgttgatgaatatctcagatgatcaacttatctcgaacctgcttatgaaaagaaacgctttgtgcaagggtaacgagggcaaggaactgtacaacgttaaccagcttgcatcgataactggttgctaa 5’ terminus atggagaacagtgccgttgcaaac BamHI(GGATCC) and extra sequence AATTAA GGATCC ATGGAGAACAGTGCCGTTGCAAAC ToCV-CP-F-Bam AATTAAGGATCCGAGAACAGTGCCGTTGCAAAC 3' terminus tacaacgttaaccaacttgcatcgataactggttgctaa complementary TTAGCAACCAGTTATCGATGCAAGTTGGTTAACGTTGTA TTAGCAACCAGTTATCGATGCAAG HindIII(AAGCTT) and extra sequence AATTAA AAGCTT TTAGCAACCAGTTATCGATGCAAG ToCV-CP-R-Hin AATTAAAAGCTTTTAGCAACCAGTTATCGATGCAAG

2 KONSTRUKSI PLASMID REKOMBINAN pQE30+CP[ToCV] UNTUK EKSPRESI PROTEIN CP
around multiple cloning site in pQE30 CATCACCATCACCATCACGGATCCGCATGCGAGCTCGGTACCCCGGGTCGACCTGCAGCCAAGCTT CATCACCATCACCATCACGGATCCatggagaacagtgccgttgcaaacactggtgataacggtggtggccgcaatcctctggttagaccgttagatgatggcgtagatgacgaggtgcagaacttgggcaggagggacgattcgacatctctcattccggctaatcctaatcgatcttccagttgggctttgttgaacccggatactattaattataacgagttaaggaaattgaaggtacactccactaggggtgatactcttaccttgactcaggaagaggagttcgagaagatactcgaatccttttgcaggcgaataatcggtgaaaccccgatgacggataagattttcgctggtttctacatgtctatgtgtcaggccattgtaaaccaagggacctcagttaaagcagccggtaataacagtcttgaaaactactttgaggtagatggtgcgagatttaagtggaaaactccggatttgataaatgaggttagacccaaaatgtccgatgttccaaacgctatacgtcggtacgccagaagtcatgaaaagattattcaggactttatcaactccggtcttattaagcctgattatcatttacaattcaaacatggcgtattgccaagccatgtgtttggtaccggcgattatataaatggttcgttgatgaatatctcagatgatcaacttatctcgaacctgcttatgaaaagaaacgctttgtgcaagggtaacgagggcaaggaactgtacaacgttaaccaacttgcatcgataactggttgctaaAAGCTT Frame 1 HHHHHHGSMENSAVANTGDNGGGRNPLVRPLDDGVDDEVQNLGRRDDSTSLIPANPNRSSSWALLNPDTINYNELRKLKVHSTRGDTLTLTQEEEFEKILESFCRRIIGETPMTDKIFAGFYMSMCQAIVNQGTSVKAAGNNSLENYFEVDGARFKWKTPDLINEVRPKMSDVPNAIRRYARSHEKIIQDFINSGLIKPDYHLQFKHGVLPSHVFGTGDYINGSLMNISDDQLISNLLMKRNALCKGNEGKELYNVNQLASITGC*

3 KONSTRUKSI PLASMID REKOMBINAN pQE30+CP[ToCV] UNTUK EKSPRESI PROTEIN CP
ToCV CP gene

4 EKSPRESI GEN CP ToCV DALAM SEL E. coli M15[pREP4]
Sel kompeten E. coli M15[pREP4] diletakkan di atas es selama 5 min sampai cair Sekitar 100 µl sel kompeten E. coli M15[pREP4] ditransfer ke dalam tabung mikro, ditambahkan plasmid kimera pQE30+ToCV-Cpgene, segera diletakkan di atas es selama 10 min Siapan diberikan perlakukan kejut panas (heat-shock) pada 42oC selama 45 s/d 50 min, segera diletakkan di atas es selama 2 min Ditambahkan 900 µl SOC µl medium, diinkubasi dengan goyangan (shaking) pada 37oC selama 60 min, kemudian 100 µl siapan ditanam pada medium padat yang mengandung antibiotika

5 SCREENING KOLONI E. coli M15[pREP4] YANG MENGANDUNG PLASMID pQE-30+CP[ToCV]
Pemotongan dengan BamHI + HindIII PCR dengan primer untuk gen CP ToCV