 Kalus : kumpulan sel yang aktif membelah, tidak terorganisasi dan tidak terdiferensiasi  Tujuan : untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi.

Presentasi berjudul: " Kalus : kumpulan sel yang aktif membelah, tidak terorganisasi dan tidak terdiferensiasi  Tujuan : untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi."— Transcript presentasi:

1

2  Kalus : kumpulan sel yang aktif membelah, tidak terorganisasi dan tidak terdiferensiasi  Tujuan : untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali

3

4  Umumnya kalus disusun oleh sel-sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang.  Kalus dapat terbentuk secara alami karena : tanaman terluka, terserang serangga atau mikroba dan karena stress.  Dalam kultur in vitro, kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang steril, di dalam media yang mengandung zat pengatur tumbuh (ZPT) berupa auksin dan sitokinin dengan perbandingan yang relatif seimbang.

5 Faktor-faktor yang mempengaruhi kemampuan pembentukan kalus dari suatu eksplan : 1. Umur fisiologi jaringan waktu diisolasi 2. Musim pada saat bahan tanaman diisolasi 3. Bagian tanaman yang dipakai : organ yang berbeda akan berbeda kec. tumbuhnya. ex.embrio muda, hipokotil,kotiledon dan batang muda. 4. Jenis tanaman : dikotil berdaun lebar, monokotil, gymnospermae, pakis dan lumut.

6  Pembentukan kalus, terjadi hanya sel di lapisan perifer (tepi) yang mengalami pembelahan secara terus- menerus. Hal ini disebabkan oleh beberapa faktor :  Ketersediaan oksigen  Keluarnya gas CO2  Kontak dengan nutrisi lebih besar  Cahaya  Penghambat yang bersifat folatik lebih cepat menguap

7 Dari eksplan batang, akar dan daun biasanya dihasilkan kalus yang heterogen dengan berbagai macam sel.  Sel-sel yang heterogen dapat disebabkan oleh komposisi media tumbuh dan masa kultur yang panjang.  Tekstur kalus : meremah (friabel) dan kompak.  Warna kalus : putih, kekuningan, hijau dan coklat.

8  Organogenesis tak langsung pada daun kumis kucing (Orthosipon sp.) kalus → tunas  Kalus dari kultur kalus dapat digunakan untuk :  Perbanyakan tanaman secara tak langsung melalui organogenesis atau embriogenesis  Bahan inokulum untuk kultur suspensi sel  Mendapatkan metabolit sekunder

9  Organogenesis tak langsung pada daun kumis kucing (Orthosipon sp.) : kalus → akar

10  Kalus perlu di subkultur : memindahkan kalus ke media baru secara teratur dalam jangka waktu tertentu.  Tujuan subkultur :  Menghindari terjadinya kehabisan hara dan air  Menghindari terjadinya penghambatan pertumbuhan kalus oleh senyawa metabolik yang dihasilkan  Interval waktu subkultur sangat tergantung pada kec. tumbuh kalus, berkisar 2-4 minggu  Masa kultur yang lama menyebabkan habituasi, perubahan siklus sel dan mitosis.

11  Ukuran inokulum untuk subkultur : diameter 5 – 10 mm atau 20 – 100 gram.  Pada kultur kalus dapat dibuat kurva pertumbuhan kalus, membentuk kurva sigmoid.  Tanaman dpt beregenerasi dari sel- sel yang tak terdeferensiasi, disebut rediferensiasi. Redeferensiasi untuk membentuk akar dan tunas.

12  Kultur sel bebas atau agregat sel kecil dalam media cair dengan pengocokan  Umumnya diinisiasi dari kalus. Kalus pda media padat bersifat asinkronus, shg perlu sinkronisasi.  Dapat digunakan untuk mempelajari metabolisme sel, diferensiasi sel dan senyawa-senyawa metabolit yang dihasilkan sel.

13  Kultur suspensi digunakan sebagai sumber :  Sel untuk protoplasma  Sel yang akan diberi diperlakuan mutagen kimia  Sel untuk studi hubungan host-patogen dalam fitopatologi  Massa untuk produksi metabolit sekunder.  Inisiasi kultur suspensi diawali dengan menginokulasikan kalus segar 200-250 mg ke dalam 40 mL media yang ditempatkan pada erlenmeyer 125 mL.  Kultur dipelihara dengan meletakkan wadah di atas pengocok berupa “shaker” dengan kecepatan putaran berkisar 90-150 rpm.

14  Tujuan pengocokan :  Pemecahan gumpalan sel menjadi agregat kecil dan sel tunggal  Distribusi sel yang merata dalam media  Pertukaran gas antara media dan udara  Jenis kultur suspensi :  Kultur Batch : kultur dalam media hara dengan volume tetap, konsentrasi hara berubah sesuai tingkat pertumbuhan sel.  Kultur Continous : kultur sel jangka panjang dengan suplai hara yang konstan dalam wadah besar.

15 Kultur continous ada 2 tipe : 1. Kultur tertutup (closed type) : sel bertambah terus tanpa dipanen, hanya media yang disirkulasi. 2. Kultur terbuka (open type) : penambahan media baru disertai dengan panen sel.Alat berupa chemostat atau turbidostat. Subkultur dilakukan setiap 1-2 minggu tergantung kecepatan pertumbuhan sel.

16 Keuntungan kultur Suspensi : -tidak ada gradien nutrisi dan gas -Semua permukaan sel kontak dgn medium -Aerasi lebih baik -Tidak ada akumulasi senyawa toksik Derajat dispersi dipengaruhi rasio auksin yang lebih tinggi dari sitokinin. Kultur suspensi tumbuh cepat shg perlu disubkultur.

17  Cara subkultur : sel diendapkan, medium dituang dengan hati-hati. Endapan sel dibagi ke dalam 2 medium baru dgn komposisi dan volume sama dengan medium lama.  Subkultur dilakukan pd awal fase stasioner.  Metode untuk mengukur laju pertumbuhan sel : Jumlah sel termampat, jumlah sel, BB dan BK.  Pengukuran pada interval waktu tertentu.

18 Hasil pengukuran diplotkan dengan waktu akan menghasilkan kurva pertumbuhan sigmoid dengan 5 fase yaitu lag, eksponensial, linear, penurunan cepat dan stasioner Fase lag : tahap persiapan membelah Fase eksponensial : laju pembelahan maksimal. Fase linear : pembelahan melambat, pembentangan sel cepat. Fase stasioner : sel tdk membelah lagi.

19  Kultur sel yang sinkronus adalah : sebagian besar sel melewati setiap fase dari siklus sel (G1, S, G2, M) secara bersamaan.  Metode untuk sinkronisasi : 1.Starvation. Menahan sel pada G1 atau G2 dgn starvasi hormon atau nutrien shg sel berada pada fase stasioner. - Subkultur pd medium kaya nutrisi dan hormon shg sel membelah secara sinkron.

20  2. Penghambatan.  Penghambatan sintesis DNA dgn hydroxyurea, thymidine atau amphydicolin.  Siklus hanya sampai pada G1 dan semua sel terkumpul pada batas antara G1 dan S.  Penghilangan inhibitor membuat sel membelah sinkron.