Spektrofotometri Ultraviolet (UV) – Visibel (Vis)

Presentasi berjudul: "Spektrofotometri Ultraviolet (UV) – Visibel (Vis)"— Transcript presentasi:

1 Spektrofotometri Ultraviolet (UV) – Visibel (Vis)
Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan Up-date Agustus 2007 Hari Susanti, M.Si., Apt.

2 Klasifikasi metode analisis (Skoog, 1-2)
Table I. Physical Properties Employed for Analysis Physical property Analytical methods based measured on measurement of property Mass Gravimetric Volume Volumetric Absorption of radiation Spectrophotometry (x-ray, UV, Vis, IR); colorimetry; atomic abs, NMR Emission of radiation Emission spectroscopy (x-ray, UV, Vis); flame photometry, fluorescence (x-ray, UV, Vis) Scattering of radiation Turbidimetry, Raman spectroscopy Electrical potential Potentiometry Mass-to-charge ratio Mass spectrometry Gravimetric dan volumetric procedures  classical methodes of analysis The remainder of the list  instrumental methods

3 Spektrofotometri UV-Vis
Fokus Spektrofotometri UV-Vis

4 Satuan 1 Å = 1 angstrom = 10-10 m = 10-8 cm
1 µ = 1 mikron = 10-6 m = 10-4 cm = 104 Å 1 mµ = 1 milimikron = 10-9 m = 10-7 cm = 10 Å (Gearien,133) 1 nm = 1 nanometer = 10-9 m = 10-7 cm = 10 Å = 1 mµ (Miller,150;Williams,1) Panjang gelombang pada daerah UV dan Vis biasanya dinyatakan dalam satuan “nm” (Miller,150)

5 Daerah UV dan Daerah Vis
Daerah UV (ultraviolet) 200 – 400 nm (Dyer,1) ← dapat dideteksi dengan film ( kcal mol-1) (Settle,485) fotografik atau sel fotolistrik (Diktat,5) Sumber sinar (Dyer,4;Settle,489;Pecsok,148;Kellner,530)  lampu “hydrogen - discharge” ← the high-voltage (180 – 400 nm)  lampu “deuterium-discharge” Daerah Vis (visibel) 400 – 800 nm (Dyer,1) ← batas sensitif mata (Diktat,4) (72-36 kcal mol-1) (Settle,485) Sumber sinar (Dyer,4;Kellner,530;Pecsok,148)  lampu “tungsten- filament” (400 – 800 nm)

6 Radiasi elektromagnetik (1)
Radiasi elektromagnetik, atau sinar  suatu bentuk energi radiasi, memperlihatkan sifat partikel dan gelombang (Pecsok,115;Harvey,369) Sifat gelombang, tergambar pada sifat optik radiasi elektromagnetik, yaitu difraksi (Harvey,369) Sifat partikel, atau foton, tergambar pada proses interaksi radiasi elektromagnetik dengan zat, yaitu pada proses penyerapan dan emisi (Harvey,369)

7 Interaksi antara sinar dan zat (Kellner dkk,528) (1)
Io = intensitas sinar sebelum mengenai sampel I = intensitas sinar yang diteruskan Perhitungan intensitas pita serapan  menggunakan hukum Lambert dan Beer (Dyer,5)

8 Interaksi antara sinar dan zat (2)
Radiasi adalah suatu bentuk energi. Interaksi antara suatu molekul dengan radiasi menyebabkan molekul bergerak dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi yaitu ke tingkat energi eksitasi (Miller,152) Radiasi pada daerah UV dan Vis mempengaruhi transisi elektronik. Energi yang serap pada transisi elektronik menyebabkan terjadinya eksitasi elektron yang terdapat pada orbital molekul ke orbital berikutnya yang mempunyai tingkat energi yang lebih tinggi; jadi elektron mengalami eksitasi dari tingkat dasar ke tingkat tereksitasi (Miller,152) Keadaan tereksitasi berlangsung sangat singkat ( detik) (Pecsok,121; Bair,21)

9 Interaksi antara sinar dan zat (Miller,152) (3)
Dalam teori : transisi elektronik tunggal memberikan garis tunggal yang tajam pada spektra serapan. Ini hanya berlaku untuk molekul dalam bentuk gas atau untuk atom dimana transisi selain elektronik ditekan. Untuk molekul dalam larutan, terlihat adanya pita serapan yang lebar pada spektra UV yang disebabkan oleh berbagai jenis transisi (elektronik, vibrasi, dan rotasi) yang saling berhubungan, dan karena interaksi solut-pelarut.

10 Eksitasi elektronik (1)
Penyerapan sinar (energi) UV dan Vis oleh molekul suatu zat organik :  disebabkan oleh eksitasi elektronik (Dyer,2)  melibatkan promosi elektron pada orbital σ,  dan n dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi (Dyer,5) Transisi elektronik () yang dilibatkan pada daerah UV dan Vis adalah tipe-tipe berikut (Dyer,6) : σ  σ*, n  σ*, n  *, dan   * Yang paling banyak pada daerah UV : transisi yang melibatkan elektron orbital n dan * (Miller,153)

11 Skema tingkat energi orbital molekul (2)

12 Electronic transitions involving , σ and n electrons (3)

13 Analisis Kualitatif (1)
Serapan sinar UV/Vis ditentukan oleh (Shimadzu, 4.4.1) - Kromofor : gugus fungsional yang menyerap sinar a.l : >C=C<, >C=O, -N=N-, -N=O, ← mempunyai multiplet bonding (Shimadzu,4.4.1) -NO2, -C=C- (Miller,154) Kromofor biasanya mengandung “ bond” (Miller,153) - Ausokrom : gugus fungsional yang tidak mempunyai serapan a.l : -OH, -NH2, -SH (dan ← punya pasangan elektron yang tidak derivatnya), dan terikat (Shimadzu,4.4.1) beberapa halogen (Dyer,11) Jika terikat dengan kromofor, gugus ini biasanya menyebabkan pergeseran serapan ke arah  yang lebih besar dan meningkatkan intensitas puncak serapan (Dyer,10-11)

14 Analisis Kualitatif (2)
Applikasi spektrofotometri UV-Vis untuk keperluan analisis kualitatif adalah sangat terbatas karena pita serapan cenderung lebar dan karenanya informasi yang diberikan kurang detail. Walaupun demikian, investigasi terhadap spektra pada daerah ini seringkali memberikan informasi yang berguna mengenai ada tidaknya gugus fungsional (misalnya karbonil, aromatis, nitro, atau diena terkonyugasi) pada suatu senyawa organik (Skoog,80-81) Spektra serapan UV/Vis sering digunakan pada saat mengidentifikasi spesies molekuler. Ini sering dilakukan dengan cara membandingkan spektrum spesies zat sampel dengan spektrum zat yang telah diketahui (berasal dari spektra literatur) (Settle,497)

15 Informasi Analisis pada range UV-Vis (a) (Kellner,531-532)
In the UV-Vis range from nm typical (khas) cromophores (light absorbing groups) can be observed; groups with n  *,   * transitions in molecular orbitals, d-d transitions in ligand fields of metal chelates and charge-transfer bonds. The omnipresent (keberadaan) σ-bonds in organic compounds and also the non conjugated (isolated) double bonds and n  δ* transitions are not excited in the normal UV-Vis range and thus do not interfere

16 Informasi Analisis pada range UV-Vis (b) (Kellner,531-532)
Absorption maxima of some conjugated chromophores Absorption maxima of nonconjugated chromophores Substances max (nm) CH3-CO-CH=CH2 225 CH2=CH-CH=CH2 217 CH3(CH=CH)3CH3 274 CH3(CH=CH)5CH3 342 CH3(CH=CH)7CH3 401 C6H6 203 C6H5-CH=CH2 248 Chromophore Transition max (nm) -C-C- σ  σ* 150 -O- n  σ* 185 -N< 195 -S- >C=O   * 190 n  * 300 (weak) >C=C<

17 Analisis Kualitatif (4)
Pergeseran serapan maksimum ke arah  yang lebih panjang  pergeseran batokromik (=pergeseran merah) (Settle,486;Miller,155) Pergeseran ini dapat disebabkan oleh terikatnya ausokrom pada kromofor (Miller,155;Williams,7) atau perubahan pelarut (Williams,7) lebih pendek  pergeseran hipsokromik (=pergeseran biru) (Settle,486;Miller,155) Pergeseran ini dapat disebabkan oleh perubahan pelarut (makin polar) atau substituen pada molekul (Miller, ), atau fenomena seperti hilangnya konyugasi (Williams,7) Kenaikan instensitas serapan, misalnya karena terikatnya ausokrom pada kromofor atau efek pelarut (makin polar)  efek hiperkromik (Miller, ) Penurunan instensitas serapan  efek hipokromik (Settle,155,486;Williams,7)

18 Analisis Kuantitatif (1)
Untuk keperluan kuantitatif : • diperlukan ε maks besar  agar konsentrasi larutan uji encer/kecil • larutan uji biasanya sangat encer (c ≤ 0,1 mol/L) (Kellner,528)  1 mg (jika BM ) dilarutkan hingga 100 ml (Williams,2) Jika pekat  yang dipantulkan yang dihamburkan  besar, sedangkan yang diserap yang diteruskan : kecil Yang dibutuhkan, yang diteruskan : besar • nilai maksimal serapan (A) adalah 1,0  A yang digunakan : 0,2 – 0,8 [0,2 - 0,650 (Willard,90)] atau T : 15 – 75% Angka ini dipilih untuk meminimalkan “errorr” dari alat

19 Analisis Kuantitatif (2)
Untuk mengetahui apakah “daerah kerja” memenuhi hukum Lambert-Beer,  dibuat kurva baku Kurva baku digunakan jika “r hitung > r tabel” kurva baku  jaminan kita bekerja dengan larutan encer yang memenuhi hukum Lamber-Beer

20 Analisis Kuantitatif (Settle,498)(3)
Ada beberapa tehnik analisis yang dikembangkan untuk jenis sampel berlainan. Penentuan secara langsung dilakukan jika molekul analit memiliki suatu kromofor. Standar harus digunakan untuk menentukan absorbsivitas sehingga konsentrasi dapat dihitung dengan persamaan berikut A = a.b.c or by establishing acalibration plot from which the concentration can be determined by graphic interpretation or by regretion analysis. Penentuan secara tidak langsung umumnya dilakukan jika molekul analit tidak memiliki “a suitable chromophore”. Dalam hal ini, analit direaksikan secara kuantitatif dengan molekul yang memiliki suatu kromofor and correlating the diminution of absorbance with the concentration of the analyte, atau dengan mereaksikannya dengan suatu reagen yang dapat membentuk suatu gugus kromofor.

21 Hukum Lambert-Beer (1) Cara menyatakan hukum Lambert-Beer :
T = I / Io = transmitan A = log (Io/I) = absorbansi (serapan) - log (I/ Io) = a.b.c log (Io /I) = a.b.c - log T = a.b.c A = a.b.c Seringkali a dinyatakan dalam ppm (mg zat/1 L larutan). Jika c dinyatakan dalam mol per liter, dan b dalam cm,  a diganti dengan ε (koefisien ekstingsi molar, = molar absorptivitas = absortivitas molar) (Dyer,5;Settle,487;Fritz,70-71) dan selanjutnya persamaan Lambert-Beers menjadi - log T = ε.b.c atau A = ε.b.c

22 Hukum Lambert-Beer (2) (Kellner,528)
A = ε . b . c dimana A : Absorbansi (= serapan) ε : molar absorptivitas (L mol-1 cm-1) c : kosentrasi larutan (mol/L) b : tebal sel ≈ tebal kuvet ≈ tebal larutan (cm) nilai c biasanya hanya untuk larutan encer (c ≤ 0,1 mol/L) Jadi, Serapan (A) proporsional dengan konsentrasi larutan zat (c) dan ketebalan sel (b)

23 Hukum Lambert-Beer (3) Jika BM suatu zat tidak diketahui, atau jika yang ditetapkan berupa campuran (Williams,8), intensitas serapan dinyatakan sebagai atau , serapan larutan zat 1% dalam kuvet 1,0 cm. Hubungannya dengan ε (Dyer,5): 10 ε = X mol. berat Contoh perhitungan serapan : 325 nm = 30 Berdasarkan persamaan diatas (Williams,8): nilai serapan atau log (Io/I) larutan adalah 30; diukur terhadap larutan dengan kadar 1% dan ketebalan larutan 1 cm, pada  325 nm

24 Hukum Lambert-Beer (4) (Skoog,87)
Faktor-faktor yang berpengaruh terhadap spektrum serapan suatu zat : - pelarut - pH larutan - suhu - konsentrasi elektrolit yang tinggi - zat asing yang mengganggu

25 Pelarut (1) Harus dapat melarutkan zat uji dan meneruskan
radiasi pada daerah  yang digunakan (Pecsok,153) Senyawa hidrokarbon jenuh dan senyawa yang hanya memiliki gugus alkil jenuh, gugus alkohol, dan gugus eter adalah transparan (tidak memberikan serapan) pada daerah mµ  dapat digunakan sebagai pelarut pada penentuan spektra yang melalui daerah ini (Dyer,8-9) Pelarut paling umum untuk penentuan spektrum UV adalah etanol 95% (Dyer,4) Etanol absolut komersial mengandung residu benzen yang memberikan serapan pada daerah UV (Williams,2)

26 Pelarut (2) Air dan heksana juga sering digunakan (Dyer,4)
Perbedaan pelarut dapat menggeser posisi puncak serapan (Dyer,4). Serapan maksimum dalam larutan etanol terjadi pada  yang lebih panjang dibandingkan dalam larutan heksana (Diktat, 31) Pergeseran merah  sekitar nm, dari pelarut heksana ke etanol (Diktat, 31) Panjang gelombang maksimum ( maks) untuk senyawa nonpolar umumnya sama dalam pelarut alkohol dan heksana;  maks untuk senyawa polar biasanya berbeda (bergeser) (Dyer,4)

27 Pelarut (Kellner,532) (3) Solvent can interact strongly with certain solutes and thus change the observed UV-Vis spectra, either by removing vibrational fine structure, or by shifting absorption band maxima, or both

28 Pelarut (4)

29 Pelarut (5a)

30 Pelarut (5b)

31 Pelarut (5c)

32 Analisis kuantitatif campuran (Pecsok,137) (1)

33 Analisis kuantitatif campuran (Pecsok,136) (2)
Jika sistem terdiri lebih dari satu komponen yang menyerap, diasumsikan : - proses penyerapan oleh spesies tidak tergantung spesies yang lain - serapan semua spesies adalah aditif Pada serapan maksimum untuk komponen I pada 1, terdapat serapan komponen II Pada serapan maksimum untuk komponen II pada 2, terdapat serapan komponen I Spektrum serapan untuk campuran I dan II merupakan jumlah kurva kedua komponen

34 Analisis kuantitatif campuran (Pecsok,136-137) (3)
Rumus Perhitungan : Pada At 1 A11 = εI1.b.cI dan AII1 = εII1.b.cII A 1 = AI1 + AII1 = εI1.b.cI + εII1.b.cII Pada At 2 A12 = εI2.b.cI dan AII2 = εII2.b.cII A 2 = AI2 + AII2 = εI2.b.cI + εII2.b.cII A 1 = serapan campuran yang diamati pada 1 A 2 = serapan campuran yang diamati pada 2 AI1 = serapan komponen I dalam campuran pada 1 AI2 = serapan komponen I dalam campuran pada 2 εI1, εI2, εII1 dan εII2 = absorbsivitas molar komponen I dan II pada 1 dan 2 CI dan CII = konsentrasi respective komponen I dan II dalam campuran

35 Conto…. Titanium and vanadium form colored complexes with hydrogen peroxide. Separate solutions containing 5.00 mg of these metals were treated with perchloric acid and hydrogen peroxide and diluted to 100 ml. A third solution was prepared by dissolving 1.00g of alloy (containing Ti and V but no other interfering metals) ang tretig in the same manner as the standart solution. The absorbance of three solutions were measured at 410 and 460 nm in 1 cm cells. Calculate the % V and Ti in the alloy Artinya???

36 Analisis kuantitatif campuran (Pecsok,137-138) (4b)
Hasil pengukuran : larutan A410 A460 Ti 0,760 0,513 V 0,185 0,250 Alloy 0,715 0,657 Dari larutan standar : ATi410 = aTi410 . b . cTi aTi410 = 0,760/5 = 0,152 Dengan cara yang sama diperoleh : aTi460 = 0,103, aV410 =0,037, aV460 = 0,050 Untuk larutan alloy : At 410 nm: 0,715 = 0,132CTi + 0,037CV At 460 nm: 0,657=0,103CTi + 0,050 Cv Solution of these simultaneous equations yields CTi = 3,0 mg/100 ml, CV = 6,9 mg/100 ml % Ti = 0, % V = 0,69

37 H. Tahapan Kerja Analisis (1)
1. Mencari “Operating Time” (OT) Tujuan : mengetahui waktu dimana suatu proses reaksi berlangsung stabil Pada saat reaksi berlangsung stabil (=pada saat OT)  diukur serapan larutan uji Pengukuran pada saat reaksi berlangsung tidak stabil  data yang diperoleh tidak menentu Bagaimana mencari dan mengetahui OT ?

38 H. Tahapan Kerja Analisis (2)
2. Mencari  maksimum (maks) Tujuan : memperoleh serapan maksimum Serapan maksimum diperoleh jika pengukuran dilakukan pada maks Perubahan serapan per unit konsentrasi pada maks adalah sangat besar (Skoog,87) “ semua yang terserap larutan uji idealnya juga terukur maksimal oleh spektrofotometer “ sehingga diperoleh hasil uji yang maksimal. maks harus dicari walaupun dalam prosedur aslinya biasanya juga telah disebutkan (petunjuk,14) Bagaimana mencari dan mengetahui maks ?

39

40 H. Tahapan Kerja Analisis (3)
3. Membuat kurva standar a. Dibuat dari satu seri larutan standar - menggunakan zat standar - dalam berbagai kadar Zat standar = zat yang diuji (terdapat dalam larutan uji) b. Diukur serapan satu seri larutan standar pada OT dan  maks yang diperoleh pada tahap 1 dan 2. Serapan tiap-tiap kadar larutan standar dicatat, dicari persamaan garis lurus dan koefisien korelasinya; absis (X) untuk konsentrasi (c) larutan standar, ordinat (Y) untuk serapan (A)

41 Kurva kalibrasi

42

43 H. Tahapan Kerja Analisis (4)
4. Mencari kadar zat dalam larutan uji a. Larutan uji dalam kuvet yang telah dipersiapkan diukur serapannya pada OT dan  maks yang telah diketahui. Dilakukan beberapa kali pengulangan pengujian (4 replikasi). b). Dengan bantuan kurva standar atau persamaan garis linier yang diperoleh dapat diketahui kadar zat dalam sampel.

44 I. Instrumen (1) Spektrofotometer
provide a plot of the intensity of transmitted or absorbed light versus wavelength (Dyer,4;Settle,488) Penggolongan berdasarkan sistem optik -- single beam Sistem optik single detector -- double beam -- -- double detector Pada double beam, sumber cahaya utama terbagi menuju 2 beam : satu menuju kuvet (mengandung larutan sampel) dan satu menuju kuvet (mengandung pelarut referensi) (Dyer, 4) Yang dimiliki Farmasi UAD ?  double beam – double detector (UV-1700)

45 I. Instrumen (2)

46 I. Instrumen (3)

47 I. Instrumen (Settle,489) (4)

48 Sumber sinar

49

50 • Filter atau monokromator
Ada beberapa cara untuk mengisolasi/mendapatkan sinar monokromatik yang diinginkan. Salah satunya adalah dengan menempatkan suatu filter di depan wadah sampel  filter dapat berupa glass filter atau gelatin filter (Wratten), yang mempunyai bandwidths yang luas dan puncak emisi yang rendah (Hicks,26) [Bandwidth (nm) glass filter : 150+, gelatin filter : 25-50; Transmisi (%) glass filter : 25-90%, gelatin filter : 5-30 (Beckett,227)] Beberapa instrumen menggunakan prisma atau diffraction gratings sebagai monokromator (Settle,490).

51 Skema monokromator prisma (Pecsok,150)

52 Sampel Sampel (molekul, ion) yang diuji pada daerah UV atau Vis biasanya berupa gas atau larutan dan ditempatkan dalam sel atau kuvet (Pecsok,153,226)

53 Kuvet Untuk Vis  dari gelas atau kuarsa (quartz) (Pecsok,153;Kellner,530) Untuk UV  harus dari kuarsa (Fritz, 77; Dyer, 4) Gelas menyerap sinar UV dengan kuat (Dyer,4) Kuvet biasanya mempunyai panjang celah 1,0 cm (Dyer,4;Skoog,50) Kuvet dari kuarsa atau gelas dapat dibersihkan dengan dibilas dengan air; jika perlu, dengan larutan deterjen atau asam nitrat panas (Pecsok,153) Dibilas dengan etanol agar cepat kering Dibilas untuk mencegah terjadinya penumpukan zat yang mengabsorbsi, pada permukaan kuvet (Settle,497)

54

55 K. Blangko (Hicks dkk., 22-23; Gearien,139)
Serapan yang terukur oleh spektrofotometer tidak hanya serapan solut dalam larutan uji melainkan juga semua molekul yang dilewati sinar. Karenanya dibuat blangko, untuk mengkoreksi pantulan, hamburan dan penyerapan oleh kuvet dan konstituen pada larutan uji. Blangko dibuat dengan menempatkan konstituen (pelarut, reagen, dll) yang digunakan pada larutan uji, ke dalam kuvet. Dengan larutan blangko selanjutnya rekorder diatur pada posisi T = 100% atau A = 0, pada  pengujian serapan solut. Setelah itu baru dilakukan pembacaan serapan solut dalam larutan uji. Dengan demikian, serapan konstituen dalam larutan uji yang diukur dapat diabaikan.

56 Detektor

57

58 Aplikasi UV/Vis (Harvey, 395-398)
Bidang lingkungan (misal : analisis berbagai logam dalam air) Bidang klinik (misal : analisis barbiturat dalam serum) Bidang industri Bidang industri farmasi : analisis antibiotika, hormon, vitamin, analgesik) Bidang industri lain : analisis makanan, cat, gelas, logam Bidang Forensik (misal : analisis narkotika, alkohol dalam darah)

59 Spektrum elektromagnetik dan sinar visibel

60 Panjang gelombang dan warna sinar

61 Literatur (1) Dyer,J.R., Applications of Absorption Spectroscopy of Organic Compounds, Prentice-Hall, Inc., USA, 1965 Settle, F.A. (Editor), Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry, Prentice-Hall PTR, New Jersey, 1997 Miller,J.M dan Growther, J. B (Editors), Analytical Chemistry in a GMP Environment, A Practical Guide, John Wiley & Sons, Inc., Canada, 2000. Williams, D.H dan Fleming, I., Spectroscopic Methods in Organic Chemistry, Edisi 5, McGraw-Hill Publishing Company, England, 1995 Bair, E.J., Introduction to Chemical Instrumentation, McGraw-Hill Book Company, Inc., USA, 1962 Willard, H.H dkk., Instrumental Methods of Analysis, edisi 4, Litton Educational Publishing, Inc., India, 1965 Kellner, R. dkk (Editor), Analytical Chemistry, The Approved Text to the FECS Curriculum Analytical Chemistry, Wiley-VCH, Germany, 1998

62 Literatur (2) Pecsok, R.L. dkk, Modern Methods of Chemical Analysis, edisi 2,John Wiley & Sons, Inc., Canada, 1976 Skoog, D.A dan West, D.M., Principles of Instrumental analysis, Holt, Rinehart and Winston, Inc., USA, 1971 Fritz, J.S dan Schenk, G.H., Quantitative Analytical Chemistry, edisi 2, Allyn and Bacon, Inc., USA, 1969 Harvey, D., Modern Analytical Chemistry, McGraw-Hill Company, USA, 2000 Gearien, J.E dan grabowski, B.F., Methods of Drug analysis, Lea & Febiger, Philadelphia, 1969 Hicks, R. dkk., Laboratory Instrumentation, Harper & Row, Publisher, Inc., USA, 1974 Anonim, Instruction Manual PharmaSpec UV-1700 series, User’s System Guide, Shimadzu Corporation, Japan, 2001