Fumarate hydratase (EC )

Presentasi berjudul: "Fumarate hydratase (EC )"— Transcript presentasi:

1 Fumarate hydratase (EC. 4.2.1.2)
Amalina Ghaisani Komarudin Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung

2 Agenda Presentasi Pendahuluan Struktur Fumarase Mekanisme Fumarase
Isolasi Fumarase Pemurnian Fumarase Karakterisasi Fumarase Kinetika Fumarase Defisiensi Fumarase

3 Pendahuluan Siklus Krebs

4 Reaksi yang Dikatalisis
Reaction: (S)-malate = fumarate + H2O

5 Tata nama enzim Fumarase
EC 4 : Lyase EC 3.1 : Carbon-Oxygen Lyase EC :Hydro-Lyase Accepted name: Fumarate Hydratase Fumarase (EC ) Hydro Lyase Lyase Carbon-Oxygen Lyase

6 Penggolongan Enzim Fumarase
Class I Fumarase A, Fumarase B Class II Fumarase C Klasifikasi berdasarkan penyusunan subunit, kebutuhan logam dan ketermostabilan. Prokaryot memiliki tiga jenis Fumarase : Fumarase A, Fumarase B dan Fumarase C

7 Struktur Fumarase C dari E.coli
Terdiri dari tiga domain, dimana posisi region 1-3 berjauhan Memiliki dua buah dicarboxylate binding site yaitu A site dan B site A site dan B site teridentifikasi memiliki area yang tidak terisi ligan

8 Residu pada sisi aktif Fumarase

9 Mekanisme Enzim Fumarase

10 Isolasi Fumarase Euglena gracilis var. bacillaris
E. gracilis + buffer 1 (50 mM triethanolamine-HCl pH 7.8 + malate 10 mM 5 mM EDTA 10 mM 2-mercaptoethanol Diisolasi dari sel yang kekurangan vitamin B-12 menggunakan metode Trypsin digestion Dimurnikan dengan sentrifugasi gradien densitas Fumarase

11 Pemurnian Fumarase Euglena gracilis var. bacillaris
+ 70 mL buffer French pressure cell pada lb/in2 Sentrifugasi x g selama 30 menit Crude extract 50 g sel Dipanaskan pada suhu 50o C selama 3,5 menit Sentrifugasi pada x g selama 20 menit Supernatan pH dibuat menjadi 7.8 dengan 2 M triethanolamine Fraksinasi dengan amonium sulfat 40 % dan 60 % Ekstrak enzim

12 Pemurnian Fumarase Euglena gracilis var. Bacillaris (lanjutan)
Dialisis dengan bufer selama 3 jam Sentrifugasi Supernatan Hasil fraksinasi Ditambah NADH, NAD+, NADPH, NADP+ Kromatografi afinitasMatrix gel Orange A Karakterisasi Fumarase

13 Karakterisasi Fumarase
Aktifitas enzim + 2 mL 50 mM potassium phospate + 50 mM malat Diukur serapan pada l 250 nm( 1 Unit enzim = 1 mmol fumarat/menit) Berat molekul SDS-PAGE (gel 10%) Native-PAGE

14

15 Hasil elektroforesis

16 Parameter kinetika Enzim Fumarase
Aktivitas maksimum pada pH 8,4 Km Malat = 0,14 mM Km Fumarat = 0,031 mM ATP merupakan inhibitor Pada 10 mM Tris-acetate (pH 7.3) dan konsentrasi malat= 1 mM, 32,2 mU E. gracilis fumarase terinhibisi 50% oleh 0,35 mM ATP.

17 Defisiensi Enzim Fumarase
Defisiensi fumarase disebabkan oleh mutasi gen yang mengkode fumarase Kekurangan Fumarase menyebabkan ensefalopati, retardasi mental yang berat, fitur wajah yang tidak biasa, kelainan otak, dan serangan epilepsi karena jumlah abnormal rendah fumarase dalam sel. Pola penurunan penyakit ini adalah autosomal resesif

18

19 Referensi Purification, Characterization and Immunological Properties of Fumarase from Euglena gracilis var. Bacilaris. Hitoshi Shibata, William E. Gardiner, Steven D. Schwartzbach. Journal of Bacteriology, Nov. 1985, P The role of the allosteric B site in the fumarase reaction. Irwin A. Rose and Todd M. Weaver. Structure of Free Fumarase C from Escherichia coli . Todd Weaver. Acta Cryst. (2005). D

20 SEKIAN DAN TERIMA KASIH