RISET MAHASISWA JENJANG S2 – S3 TAHUN 2007 Analisis Polimorfisme Gen TCR  dan TCR  : Pengaruhnya Terhadap Expresi Protein BRLF1 pada Penderita Karsinoma.

Presentasi berjudul: "RISET MAHASISWA JENJANG S2 – S3 TAHUN 2007 Analisis Polimorfisme Gen TCR  dan TCR  : Pengaruhnya Terhadap Expresi Protein BRLF1 pada Penderita Karsinoma."— Transcript presentasi:

1 RISET MAHASISWA JENJANG S2 – S3 TAHUN Analisis Polimorfisme Gen TCR  dan TCR  : Pengaruhnya Terhadap Expresi Protein BRLF1 pada Penderita Karsinoma Nasofaring (KNF) di Indonesia Dwi Anita Suryandari, Purnomo Soeharso dan Daniel J. Wahyono Departemen Biologi Medik, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia, Jakarta.

2 Karsinoma Nasofaring (KNF)  Penyakit keganasan (maligna) epitel nasofaring yang konsisten dengan infeksi virus Epstein-Barr (EBV)  Frekuensi kejadian KNF bervariasi dan berbeda signifikan dalam distribusi geografis : – 50 / di Cina Selatan (Guang Dong) / di Thailand keturunan Cina / di Asia Tenggara  Di Indonesia KNF merupakan keganasan THT peringkat I

3 KNF adalah penyakit genetik multifaktorial & bersifat endemik, dipengaruhi oleh :  Faktor lingkungan : - infeksi EBV kebiasaan & pola hidup  Faktor genetik  peningkatan resiko sakit pada ras & populasi tertentu.

4 Reseptor sel T (TCR)  Reseptor antigen (Ag) dipermukaan sel T, mengenal Ag yang dipresentasikan molekul MHC di permukaan sel  Terdiri dari dua subunit protein β atau γδ TCR β diexpresikan sel T sitotoksik dan helper, TCR γδ diexpresikan sel NK  Memediasi reaksi sitotoksik & fagositosis untuk mengeliminasi sel terinfeksi virus dan/atau sel tumor  Polimorfisme gen reseptor sel T berimplikasi pada modifikasi respon seluler & berhubungan dengan suseptibilitas individu terhadap infeksi dan kerentanannya terhadap penyakit/maligna.

5

6 Gen TCR yang mengkode rantai TCR  berlokasi dalam lokus TCR  pada kromosom 14q11-12, sementara TCR β dan TCR  berlokasi pada posisi kromosom 7q32-35 dan 7p15.

7 Polimorfisme gen TCR  TCR β dapat dideterminasi dengan PCR-RFLP menggunakan enzim restriksi Bgl II Dipresentasikan oleh 2 alel : fragmen DNA tidak terpotong Bgl II  alel a fragmen DNA terpotong Bgl II  alel b  TCR  dapat dideterminasi dengan PCR-RFLP menggunakan enzim restriksi Pvu II Depresentasikan oleh 3 alel : fragmen DNA tanpa situs restriksi Pvu II - alel p fragmen DNA dengan situs restriksi Pvu II – alel q fragmen DNA dengan insersi exon II tanpa situs restriksi Pvu II – alel r  Genotip & Alotip TCR  terdistribusi secara bebas / acak di dalam populasi.

8 Gambar 4.1. Situs polimorfik gen TCRß pada segmen Cß1-Cß2
BglII* Cß1 Cß2 Alel a (229 pb) : segmen Cß1-Cß2 Alel b (142 pb&87 pb) : segmen Cß1- situs restriksi BglII dan situs BglII - Cß2 Gambar 4.1. Situs polimorfik gen TCRß pada segmen Cß1-Cß2

9 Gambar 4.2. Situs Polimorfik TCRγ pada segmen Cγ2
Ex I Ex IIa Ex IIb Ex III 1. Alel p (11,5 kb) = P1 – P2* dan Alel q (13 kb) = P1 – P3 P1 P3 Ex I Ex IIc Ex IIa Ex IIb Ex III 2. Alel r (16 kb) = P1 – P3 Gambar 4.2. Situs Polimorfik TCRγ pada segmen Cγ2

10 Gen BRLF1  Gen litik EBV yang hanya diexpresikan oleh tumor KNF
Gen BRLF1  Gen litik EBV yang hanya diexpresikan oleh tumor KNF.  Mengexpresikan Rta (BRLF1 transcription activator) yang berperan aktif untuk replikasi virus dan mengatur /memodifikasi siklus sel  memacu patogenesis & progresifitas tumor.  Rta mempunyai beberapa epitop yang dikenali oleh sel T sitotoksik.

11 Masalah. 1. Apakah ada beda distribusi alotip TCR  & TCR  pada
Masalah Apakah ada beda distribusi alotip TCR  & TCR  pada penderita KNF apabila dibanding dengan kontrol sehat di dalam populasi Indonesia Apakah ada pola distribusi alotip TCR  & TCR γ yang khas pada kelompok etnis atau suku tertentu di Indonesia Apakah individu pembawa alel TCR  & TCR γ tertentu lebih suseptibel terhadap infeksi EBV dan rentan terkena KNF Apakah expresi BRLF1 dapat dipakai sebagai penanda (marker) patogenesis dan mempunyai korelasi positif dengan progresifitas tumor.

12 Tujuan Mengetahui distribusi alotip gen TCR  & TCR  pada populasi Indonesia dan hubungannya dengan suseptibilitas individu terhadap infeksi EBV dan kerentanannya menderita KNF Mendapat kesimpulan tentang expresi BRLF1 (pada tingkat mRNA) pada individu dengan genotip TCR β dan TCR γ tertentu, serta implikasinya pada patogenesis dan progresifitas tumor KNF.

13 Manfaat Memberi acuan kepada peneliti dan praktisi (klinisi) tentang pengaruh faktor genetik khususnya varian (genotip/alotip) TCR  dan TCR γ pada patogenesis dan progresifitas tumor KNF dengan penanda mRNA BRLF1 untuk membantu menentukan prognosis penyakit dan pilihan terapi yang tepat dan akurat bagi penderita KNF di Indonesia.

14 Metodologi I. Analisis polimorfisme gen TCR β dan TCR γ. A
Metodologi I. Analisis polimorfisme gen TCR β dan TCR γ A. Persiapan / Pradeterminasi alotip TCR  & TCR γ 1. Koleksi / pengumpulan sampel dari pasien KNF & kontrol sehat  darah dengan antikoagulan (EDTA) 5 ml pasien KNF (didiagnosis dokter radioterapi (RSCM)  53 orang kontrol sehat (tidak menderita KNF)  48 orang Desain primer untuk PCR daerah polimorfik dengan program Prime 3 output menggunakan data yang diakses dari “gene bank NCBI ”

15 B. Determinasi Alotip TCR  & TCR γ
Sampel darah Pasien KNF Sampel darah Kontrol sehat Ekstraksi DNA dari MNC PCR dengan primer spesifik RFLP dengan enzim restriksi Elektroforesis Koleksi data

16 C. Pasca determinasi alotip TCR 
C. Pasca determinasi alotip TCR  Analisa statistik untuk melihat frekuensi alel TCR  & TCR γ di dalam populasi Menggambarkan pola distribusi genotip dan alotip TCR  & TCR γ di dalam populasi.

17 Hasil Amplifikasi gen TCR  (Cβ1- Cβ2) sebesar 229 pb
5 M 1 2 3 4 6 B 500 pb 1000 bp Keterangan : M = marker, B = blanko, lajur 1-6 = sampel no. 1-6

18 Hasil RFLP pada rentang antara situs Cβ1-Cβ2 gen TCR β dengan enzim Bgl II
8 3 M 1 2 4 5 6 7 9 AA AB BB 229 pb 142 pb 87 pb 300 pb 200 pb 100 pb

19 Hasil Amplifikasi gen TCR γ (region C2) sebesar 295 pb

20 Hasil RFLP pada rentang antara situs Cγ2 gen TCR γ dengan enzim Pvu II
295 pb  206 pb  89 pb

21 II. Uji expresi gen BRLF1 dari jaringan tumor KNF
BAHAN & CARA KERJA BIOPSI JARINGAN TUMOR ISOLASI RNA cDNA KUALITATIF RT-PCR KUANTITATIF RT-PCR ANOVA

22 Tabel I. Distribusi genotip dan frekuensi alel TCR  pada pasien KNF dan kontrol sehat.
Kelompok Total Genotip Frekuensi Alel aa ab bb a (%) b (%) KNF 53 9 17 27 33,0 67,0 Kontrol 65 5 20 40 23,1 76,9 2 = ,10 > P > 0,05

23 2 = P > 0,05 Kelompok Total Genotip Frekuensi Alel aa ab bb a (%)
Tabel 2. Distribusi genotip dan frekuensi alel TCR  pada populasi Indonesia asli dan etnis Cina di Indonesia. Kelompok Total Genotip Frekuensi Alel aa ab bb a (%) b (%) Indonesia Asli 96 13 29 54 28,6 71,4 Cina 21 1 8 12 23,8 76,2 2 = P > 0,05

24 Kesimpulan. 1. Frekuensi alel TCR  pada KNF tidak berbeda nyata
Kesimpulan Frekuensi alel TCR  pada KNF tidak berbeda nyata dengan kontrol sehat pada P > 0,05 tetapi berbeda nyata pada P < 0,10. ( 0,10 > P > 0,05 ) dimana alel a cenderung meningkat pada pasien KNF  alel a berpredisposisi pada patogenesis KNF Frekuensi alel TCR  pada etnis Cina di Indonesia tidak berbeda nyata dengan yang terjadi pada populasi Indonesia asli  etnis Cina di Indonesia mempunyai resiko terkena KNF sama besar dengan Indonesia asli Telah terjadi transmisi gen secara bebas antara etnis Cina dan Indonesia asli selama beberapa generasi.

25 Identifikasi alel TCR γ TCR γ mempunyai 3 alel p, q dan r diidentifikasi dengan PCR-RFLP menggunakan enzim restriksi Pvu II. - Alel p teridentifikasi sebagai fragmen DNA 295 pb - Alel q teridentifikasi sebagai fragmen DNA 206 pb dan pb - Alel r belum teridentifikasi karena teknik untuk deteksi insersi exon II sebesar 3 kb belum optimal.

26 Uji expresi gen BRLF1- EBV pada biopsi tumor KNF baru dalam taraf persiapan dan optimasi teknik laboratorium : - isolasi mRNA dari jaringan tumor - sintesis cDNA dari mRNA dengan RT (reverse transcriptase) –PCR. - kuantitasi cDNA dengan RT (real time) - PCR .

27 TERIMA KASIH ATAS PERHATIAN ANDA