KLT DENSITOMETER ny Guntarti FARMASI 2013.

Presentasi berjudul: "KLT DENSITOMETER ny Guntarti FARMASI 2013."— Transcript presentasi:

1 KLT DENSITOMETER ny Guntarti FARMASI 2013

2 Kromatografi kertas

3 Kromatografi lapis tipis

4 KLT DENSITOMETER Metoda analisis instrumental yang berdasarkan interaksi radiasi elektro magnetik dengan analit yang merupakan noda pada KLT Alat dilengkapi dengan spektrofotometer yang mempunyai pancaran sinar yang panjang gelombang diatur dari nm. Uji kualitatif dan kuantitatif dengan sistem absorbsi sinar atau emisi sinar (flouresensi)

5 Teknik penggunaannya : - Pengukuran sinar yang diserap dan diteruskan (hanya untuk TLC dengan pendukung gelas), - Sinar yang diserap dan dipantulkan - Atau sinar yang dipendarkan. Susunan optik densitometer ini tidak banyak berbeda dengan spektrofotometer tetapi pada densitometer digunakan alat khusus reflection photomultiplier, sebagai pengganti photomultiplier pada spektrofotometer. 5

6 Pada era perkembangan teknik kromatografi saat ini pemakaian "Thin Layer Chromatograph Scanner" yang lebih populer dengan nama densitometer makin banyak dipakai . 6

7 lnteraksi radiasi elektrornagnetik dengan noda pada KLT secara :
Absorpsi Transmisi Pantulan (refleksi) pendar fluor Pemadaman pendar fluor   7

8 Sumber Radiasi Pada umumnya spektrofotodensitometer memberikan rentang gelombang penentuan nm. Lampu D2 (Deuterium) dipakai untuk pengukuran pada daerah ultra violet dan lampu tungstein pengukuran pada daerah sinar tampak. Untuk penentuan pendar fluor dan pemadaman pendar fluor dipakai lampu busur Hg bertekanan tinggi. Pada densitometri juga dilakukan penentuan transmisi atau absorpsi dan retleksi pada panjang gelombang maksimal.

9 Pada penentuan pendar fluor dan pemadaman pendar fluor diukur pada panjang gelombang dimana terjadi emisi atau intensitas relatif pendar fluor yang optimal. Monokromator dipakai monokromator kisi difraksi Detektor PMI' (Photo Multiplier Tube = Tabung Penggandaan Foton) merupakan detektor umum yang dipakai pada densitometer.

10 Densitometri diutamakan untuk analisis kuantitatif analit-analit dengan kadar yang sangat kecil yang yang merupakan hasil pemisahan dengan KL T. S.Levi dan Reisfeld telah mengangkat metode densitometrik ke tingkat analisis kuantitatif ultramikro. Keduanya telah berhasil meneliti testosteron dalam cairan biologis pada rentang kadar (1 hingga 250) ng, LSD dengan kadar (2-150) ng, dan kholesterol (4 -150) ng dengan pengukuran pendaran pada noda (kromatogram) KLT. 10

11 Lanjutan Penentuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area noda pada KLT akan lebih terjamin kesahihannya dibanding metode KCKT (Kromatografi Cair kinerja Tinggi) atau KGC (Kromatografi Gas Cair). sebab area noda kromatogram diukur pada posisi lurus atau "Zig-zag" menyeluruh. Korelasi kadar analit pada noda kromatogram yang dirajah terhadap area tidak menunjukkan garis lurus, akan tetapi merupakan garis lengkung mendekati parabola 11

12 Kurva hubungan serapan dan kadar
Persamaan Kubelka-Munk  Korelasi kadar analit yang dirajah terhadap area kromatogram tidak merupakan garis lurus. Bila REM (Radiasi Elektro Magnetik) dengan intensitas semula (I0) jatuh pada permukaan lapisan tipis yang tidak homogen dengan arah rambatan tegak lurus, maka sebagian dari REM tersebut akan: direfleksikan (Is) diserap oleh analit lapisan tipis (I) diteruskan (It). I=10 + Is + It 12

13 Intensitas REM yang direfleksikan tergantung pada koefisien permukaan lapis tipis (E), yang dinyatakan sebagai : Is = I. E Harga E sangat dipengaruhi oleh jenis lapisan tipis yang dipakai. Selanjutnya akan didapat :  I0 =I-Is I0=I-I.E=(I-E)I Apabila lapisan tipis tersebut merupakan lapisan tipis yang homogen maka akan berlaku hukum Lambert Beer seperti pada spektrofotometri. It =I0. e-KX 13

14 E = koefisien permukaan lapis tipis ↓
Hk. Lambeert Beer → It = I0 . e-kt x = tebal medium lapis tipis k = koefisien absorbsi e-kt = berkurangnya I radiasi elektro magnetik yang melewati medium → “ Optical density” Parameter S (koef. Penghamburan) It =I0. e-KX

15 K (koefisien absorbsi) S (koefisien penghamburan).
Oleh sehab itu pada metode spektrofoto-densitometri dikenal parameter : K (koefisien absorbsi) S (koefisien penghamburan).  Karena adanya parameter S inilah terjadi penurunan intensitas radiasi yang masuk medium lapis tipis yang dihamburkan oleh partikel-partikel fase diam. 15

16 Parameter S (koef. Penghamburan)
Menyebabkan penurunan I radiasi yang masuk ke medium lapis tipis Sx = tiap pelat berbeda harganya = 0 -10 dl dx = + (S + K ) I + Sj - = - (S + K ) I + Sj dl dx +

17 I = radiasi elektromagnetik yang arahnya tegak
lurus menuju permukaan lapis tipis j = radiasi elektromagnetik yang arahnya meninggalkan permukaan lapis tipis S = faktor hamburan untuk tiap satu satuan tebal lapis tipis K = faktor penyerapan/absorpsi untuk tiap satu satuan tebal lapis tipis X = tebal lapisan untuk tiap satu satuan tebal lapis tipis

18 Pernyataan Kubelkan – Munk :
( I – R )2 2R = E x C S E = absorbsi radiasi elektromagnetik oleh analit pada pelat KLT C = kadar analit R = cahaya terpantul pada permukaan lempang ↓ Korelasi area analit dengan kadar dinyatakan sebagai kurva parabola : A2 = f ( C ) log A = f ( log C )

19 Bagan Alat densitometer
Gambar Sumber Sinar Photo multiflier Untuk refleksi Sinar polikromatis Sinar pantulan Sinar Mono kromator Monokromator Densitometer Double beam Densitometer Single beam Photomultiflier Untuk sinar yang diteruskan 19

20

21 Bagan konfigurasi densitometer cara sinar tunggal (a), ganda (b)
PM Lempeng T S Mk I S Mk PM PS Lempeng ( a ) ( b ) Bagan konfigurasi densitometer cara sinar tunggal (a), ganda (b)

22 Photomultiflier tersebut dapat memperbesar tenaga beda potensial listrik sehingga mampu menggerakan integrator. Integrator dengan sistem mikrokomputer secara langsung dapat menghitung luas puncak atau tinggi puncak secara otomatik. Selain itu mencatat nomer urut, kedudukan puncak pada ordinal Y atau waktu retensinya. Letak sumbu Y dan X dari lempeng akan mempengaruhi hasil yang diperoleh. Kalau Y disesuaikan dengan arah gerak eluen dan sumbuk X tegak lurus padanya atau merupakan deretan penotolan sampel pada lempeng. Dengan cara itu mereka akan mendekati kepastian. 22

23 Cara kerja pelacakan bercak Densitometer
Gambar 7 2 3 145 0,245 5b 5a 1 4 6 Gambar Densitometer Model CS-930 Shimadzu, 1= pendukung Lempeng. 2=Sistem optik (sinar). 3=Sumber sinar (UV/Visibel) 4= Tombol penggerak lempeng, 5a= Angka kedudukan lempeng (mm) 5b= angka serapan 6= Key Board, 7= kromatogram 23

24 Cara Kerja Densitometer
Lempeng yang telah digunakan untuk pemisahan. diuji dulu kedudukan setiap bercak pada sumbu(X,Y). agar sinar dapat tepat mengenai pusat bercak. Setelah tombol dihidupkan lempeng ditempat kan pada satu garis deretan Y, bercak diatur, dan gerakan lempeng diatur sesuai kedudukan bercak, menggunakan mikrokomputer. Panjang gelombang diprogram agar terjadi serapan secara maksimum, bila belum diketahui dilakukan scanning lebih dulu. 24

25 Scanning pengujian kuantitatif ada 2 cara :
A. Cara memanjang Sinar dilewatkan pada tengah bercak, sehingga bercak hanya dideteksi sepanjang garis tengahnya sepanjang sumbu Y,(Y1 sampai Y2). Hasilnya baik bila bercak berbentuk bulat semetris. B. Sistem zig-zag Sistem ini diprogram berjalan memanjang sumbu Y tetapi berbelok -belok sampai garis tepi bercak pada garis X, sehingga bergerak dari Y1-Y2, dan X1-X2. 25

26 Pelacakan bercak, Gambar. Cara pelacakan bercak dengan TLC Scanner (a) Model zig-zag. ( b). model lurus Kelebihan penggunaan metode zig-zag lebih merata pengukurannya, apalagi delta Y menggunakan jarak terkecil. Kelemahannya waktu lebih lama, tetapi ketelitian pengukuran lebih terjamin dibanding penggunaan metode pengamatan lurus. y1 y2 a b x1 x2 26

27 Keterangan tambahan Besarnya bercak, dari X1 sampai X2 lebih besar dari garis tengah bercak agar semua bercak teruji. Delta Y, selisih garis kesatu dan kedua makin kecil makin rata pengukurannya, antara 0,001 sampai 0,1 mm, kode yang diberikan angka 1 sampai dengan 3. Simbul Y tergantung dalam meletakkan lempeng terhadap arah scanning, (lihat panah) sesuai garis Y, dan garis tegak lurus Y adalah garis X. 27

28 Perhitungan luas atau tinggi puncak sudah dilakukan secara otomatis oleh alat, satuan luas area (mikro volt) yang tertera merupakan besaran puncak. Kadang-kadang prosentase yang tertulis hanya merupakan kadar relatif dari puncak yang muncul (tergambar). Dalam pengamatan lurus bila bercak nya tidak semitris akan kurang teliti sebab konsentrasi terbesar tidak selalu dilewati sinar pelacak bercak. Penotolan dengan bercak kecil kemungkinan molekul senyawa untuk mengumpul ditengah lebih banyak. 28

29 Panjang gelombang (nm)
Analisis Kualitatif Analisis kualitatif hanya dapat dibandingkan waktu retensinya, atau dilakukan penyarian dari bercak setelah dielusi, dan kemudian diuji secara spektroskopi. Tetapi adanya densitometer, spektrogramnya dapat diuji. Sinar mono kromatis Propil spektrogram Intensitas Serapan ` Bercak Panjang gelombang (nm) 29

30 Cara Menyari/ekstrasi
Bercak pada lempeng yang dilihat dibawah sinar UV diberi tanda (lingkari) dengan ujung pensil, kemudian diambil lapisan tipis bersama bercaknya. Lapisan yang diambil dimasukkan ke dalam gelas piala, ditambah pelarut yang sesuai (etanol/ kloroform), diaduk, dan setelah larut, disaring. Kedalam labu takar, dan cairan dijadikan volume sampai tepat tanda ( 10,0 ml). Larutan siap diuji dengan alat spektrofotometer.

31 Larutan yang didapat diuji dengan spektrofotometer pada panjang gelombang serapan maksimumnya.
Karena pengenceran merupakan faktor penting untuk perhitungan kadar senyawa yang diuji secara kuantitatif segala caranya, Disaring Diencerkan Dilarutkan

32 Gambar Chamber yang banyak digunakan
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (TLC) Gambar Chamber yang banyak digunakan Chamber lempeng Tutup dapat diganti, dengan tutup yang dapat dihubungkan pompa hampa, dapat digunakan untuk menyimpan lempeng yang telah dikeringkan

33 *Chamber harus dijenuhkan dulu selama lebih kurang 30 menit dengan bantuan kertas saring.
*Penguapan dari fase gerak dari permukaan lempeng, dalam chamber yang tidak jenuh akan menghasilkan Rf yang lebih besar, reproducibility hasil keterulangan Rf tak bagus dan permukaan fase gerak akan konkap. *Fase gerak yang tidak mau campur dengan sempurna akan menghasilkan chamber yang tidak jenuh

34 Lempeng Lempeng HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatografi) atau KLTKT (kromatografi lapis tipis Kinerja Tinggi) tidak dapat digunakan untuk preparatif (butuh lempeng cukup banyak), maka hanya untuk analisis kuantitatif Pelacak bercak untuk analisis kuantitatif dapat digunakan densitometer baik menggunakan pereaksi bercak lebih dulu maupun langsung menggunakan pelacak sinar ultra ungu, sinar tampak maupun sinar fluoresensi. (Didiskusikan tersendiri)

35 ALAT HPTLC= HIGH PERFORMANCE THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
1 2 3 4 1. Pelacak bercak Monitor 3. PC Key Board

36 Penotolan Pipa kapiler Totolan Totolan manual.

37 Chamber Tempat elusi Lempeng Silica gel Bercak Cairan elusi

38 JALANNYA SINAR (OTIK)

39

40 Aplikator, penotol sampel otomatik

41 HASIL SCANNING SATU BERCAK

42 Scanning senyawa yang berbeda
Digunakan metode: Satu persatu dgn lambda serapan maksimumnya. Cara serentak, dgn menggunakan lambda yang dapat dimiliki oleh semua senyawa. b Senyawa a1, a2, berbeda, sehingga mempunyai serapan maksimum pada lambda yang berbeda. 1 b b 2 a a a Demikian pula senyawa b1, b2, berbeda, sehingga mempunyai serapan maksimum pada lambda yang berbeda. 2 1

43 Hasil Rekaman Hasil a a 2 1 b b 2 1 Kurva a Kurva a 1 2 Kurva a + a 2
Cara satu persatu a a 1 2 b b 2 1 Kurva a Kurva 1 a 2 Cara serentak Kurva a + a 1 2 Kurva b Kurva b 1 2 Kurva b + b 1 2

44 HASIL SCANNING SERENTAK
HASIL ELUSI HASIL SCANNING SERENTAK BERCAK BAKU BERCAK SAMPEL SEBELUM ELUSI

45 Scanning tiap bercak dengan lambda berbeda

46 Scanning serentak beberap puncak/bercak

47

48 MENGHITUNG WAKTU RETENSI
Rf = a/c (cm) b/c (cm) z Batas eluen d y x e a f b C Yang ditampilkan oleh rekaman Arah scanning Bila rekaman kekanan Rf =x/z atau y/z Karena alat tak tau berapa jarak migrasi eluen Bila rekaman kebawah Rf =d/f atau e/f Karena alat tak tau berapa jarak migrasi eluen, dan tempat penotolan

49 Isotetrasiklin Rf =0,02 (coklat), Anhidroterasiklin Rf=0,3(merah-ungu)
Contoh 1 Analisis golongan tetrasiklin, dengan fase diam : seluluse F, Fase gerak : larutan MgCl2 0,25 M. (Nornendy, 1993). Kromatogram tetrasiklin dan turunannya dilihat dibawah sinar UV, 366 nm Isotetrasiklin Rf =0,02 (coklat), Anhidroterasiklin Rf=0,3(merah-ungu) Terasiklin HCl Rf =0,73 (merah ungu) 0; , 49

50 TETRASIKLIN Tetrasiklin C22H24N2O8 sda
Klortetrasiklin C22H23N2O8Cl Cl Oksitetrasiklin C22H24N2O OH

51 Penjelasan Tetrasiklin
Turunan tetrasiklin dapat membentuk khelat dengan logam bervalensi +2 sehingga tidak akan baik bila digunakan silika gel GF. Tetrasiklin dapat membentuk ikatan kompleks dengan Ca++ sehingga tak dapat dielusi sempurna. Bila digunakan selulusa sebagai fase diam, terdapat batas kelarutan dalam selulusa, dan terjadi ikatan hidrogen. Dengan eluen larutan MgCl2,tetrasiklin dapat membentuk ikatan kompleks lebih baik dibanding yang lain. 51

52 Struktur kimia Gambar N(CH3)2 H3C OH H3C N(CH3)2 N(CH3)2 H3C OH OH OH
CONH2 OH CONH2 OH O O O OH O O O OH OH OH O CONH2 Anhidro Tetrasiklin Iso Tetrasiklin Tetrasiklin HO NH2 SO3Na CH3 HC -N=N- -N=N- -N=N- SO3Na HO Kuning AB Kuning no.3 Pomceo Tartrazin CH3 SO3Na NH2 SO3Na Na O3S -N=N- -OH -N=N- Kuning OB (kuning no.4) Oranye I 52

53 Analisis zat warna lipstik, fase diam : silika gel,
Contoh 2. Analisis zat warna lipstik, fase diam : silika gel, fase gerak : campuran n-isopropil etilasetat dan amoniak 10% (65:75:60) ( Wulan dkk, 1991) Kromatogram zat warna lipstik Tartasin Rf =0, 12 (merah muda) Kuning AB Rf= 0,48 (kuning) Kuning OB Rf =0,67 (kuning hijau) Oranye I C, Rf=0,88 (putih) Poncou SX, Rf=0,98 (kemerahan) 0; , 53

54 Penjelasan Zat Warna Berdasarkan kepolarannya adalah : tartrazin poncou, oranye I, kuning AB, kuning OB (paling kurang larut dalam air). Fase gerak berupa amoniak 10%, maka tartrazin kurang larut dalam fase gerak, tetapi mudah larut dalam pelarut organik. Tartrazin sifat base lebih kuat, dari pancou sehingga paling lambat migrasinya dalam suasana basa (amoniak 10%). Bila zat warna tidak discanner, tetapi bercak disari kemudian diencerkan etanol sampai 5,0 ml. Larutan yang didapat diuji dengan spektrofotometer pada panjang gelombang serapan maksimumnya: 54

55 Analisis Kuantitatif Analisis kuantitatif diperlukan senyawa baku pembanding, dan dibuat kurva regresi linier. Untuk menguji tetrasiklin yang tidak mengalami degradasi digunakan cara analisis dengan KLT Dibuat kurva baku hubungan kadar (mcg/ml) dan luas puncak (mV). Data Kadar Luas puncak 0,0 mcg , mV 5 mcg ,5468 mV 10 mcg ,6856 mV 15 mcg ,0454 mV 20 mcg ,9754 mV 25 mcg ,356 mV 30 mcg  ,675 mV Dari data ini dapat dibuat kurva baku regresi linier yang kemudian dapat digunakan untuk menghitung kadar sampel yang tak diketahui tetapi terbaca luas areanya.

56 Kurva regresi linier normal
Y= X 56

57 Aplikasi Garis regresi
Persamaan kurva kromatogram yang didapat pada pengamatan tetrasiklin mempunyai persamaan regresi linier sebagai berikut: Y = 0,513 X + 1,487 , R- 0,9996  Contoh menghitung: Misal luas puncak pada sampel 24,487 mV, Maka harga X : = (24,487-1,487): 0,513 = (23)70,513 =44,834 mcg/ ml

58 Untuk analisis kuantitatif zat watna tidak discanner tetapi bercak disari kemudian diencerkan etanol, dan diencerkan sampai 5,0 ml. Cara penyarian, pemisahan dan pengenceran harus optimal. Untuk membuat kurva baku diperlukan lempeng yang besar untuk elusi senyawa baku yang berbeda kadarnya.

59 Yang perlu Diperhatikan Dalam uji Kuantitatif
1. Pemisahan antara obat 2. Liniritas kadar yang dapat diuji 3. Ketelitian hasil 4. Ketepatan hasil.

60 Hasil penelitian Rhodamin
a. Hasil Uji Kualitatif (benang wol) No Nama Sampel Warna Benang Wol Hasil Uji 1 Kerupuk bunga (tersanjung) Merah muda + 2 Kerupuk bawang Tidak merah muda - 3 Kerupuk ketela 4 Kerupuk rengginang ketan 5 Kerupuk rengginang beras 6 Kerupuk slondok 7 Kerupuk unyil 8 Kerupuk taro 9 Kerupuk lotek 10 Kerupuk angin

61 Hasil kromatogram uji kualitatif Rhodamin B pd UV 254 nm dan 366 nm
Hasil kromatogram uji kuantitatif UV 254 nm dan 366 nm a. Kerupuk ketela

62 b. Kerupuk bunga (tersanjung)
c. Kerupuk unyil

63 A. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk ketela:
1. Standar Rhodamin B 2. Sampel kerupuk ketela Kadar (mg/100ml) Luas Area (milivolt) 0,005 0,7092 0,015 0,8493 0,030 0,8582 0,060 2,8790 0,090 3,2248 0,120 4,5278 Replikasi Luas area (milivolt) 1 1,3010 2 1,0251 3 1,1926 4 1,4120 5 1,2412 6 1,0307 7 0,7282

64 B. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk bunga
1. Standar Rhodamin B 2. Sampel kerupuk bunga Kadar (mg/100ml) Luas area (milivolt) 0,005 0,4425 0,015 1,1420 0,030 1,5273 0,060 3,0667 0,090 4,2450 0,120 5,1967 Replikasi Luas area (milivolt) 1 2,1328 2 1,7314 3 1,2856 4 1,4730 5 1,0555 6 1,0966 7 0,6985

65 C. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk unyil
1. standar Rhodamin B 2. Sampel kerupuk unyil Kadar (mg/100ml) Luas area (milivolt) 0,005 0,4865 0,015 0,9649 0,030 1,3910 0,060 1,6812 0,090 2,1991 0,120 2,2197 Replikasi Luas area (milivolt) 1 0,5340 2 0,7687 3 0,5636 4 0,5116 5 0,5502

66 Kesimpulan penggunaan HPTLC
a. HPTLC dapat digunakan untuk memisahkan dan menganalisis campuran senyawa antara 20 sampai 30 senyawa. b. Biaya pemeliharaan, operasinal, jauh lebih murah dari HPLC. c. Cara deteksinya bercak(senyawa) pada lempeng lebih banyak pilihan dari HPLC walaupun dengan pereaksi warna. d. Pemisahan yang terjadi pada HPTLC lebih dari 10 menit, sedangkan HPLC mungkin lima menit sudah selesai. e. Ketilitian dan ketepatan mendekati HPLC.