Rangkuman Hasil Penelitian Hibah Team Penelitian Pascasarjana (HTPP) 2008 Perubahan Eksistensi DNA Virus Epstein-Barr (EBV) dan Ekspresinya Untuk Memantau.

Presentasi berjudul: "Rangkuman Hasil Penelitian Hibah Team Penelitian Pascasarjana (HTPP) 2008 Perubahan Eksistensi DNA Virus Epstein-Barr (EBV) dan Ekspresinya Untuk Memantau."— Transcript presentasi:

1 Rangkuman Hasil Penelitian Hibah Team Penelitian Pascasarjana (HTPP) Perubahan Eksistensi DNA Virus Epstein-Barr (EBV) dan Ekspresinya Untuk Memantau Efektivitas Radioterapi dan Kemoterapi pada Penderita Karsinoma Nasofaring (KNF) dengan Memperhatikan Variasi Genetik yang Menentukan Prognosis Penyakit dan Hasil Terapi Peneliti I : Drs. Purnomo Soeharso, Ph.D. Departemen Biologi Medik FKUI, Jakarta Peneliti II : Prof. Dr.dr. Susworo, SpRad (K) Rad Onk Departemen Radioterapi FKUI/RSCM, Jakarta Peneliti III : Dr. Dwi Anita Suryandari, MS

2 Karsinoma Nasofaring (KNF)  Penyakit keganasan (maligna) epitel nasofaring yang konsisten dengan infeksi virus Epstein-Barr (EBV)  Frekuensi kejadian KNF bervariasi dan berbeda signifikan dalam distribusi geografis : – 50 / di Cina Selatan (Guang Dong) / di Thailand keturunan Cina / di Asia Tenggara  Di Indonesia KNF merupakan keganasan THT peringkat I

3 KNF adalah penyakit genetik multifaktorial & bersifat endemik, dipengaruhi oleh :  Faktor lingkungan : - infeksi EBV kebiasaan & pola hidup  Faktor genetik  peningkatan resiko sakit pada ras & populasi tertentu.

4 Pendekatan teoritik : 1. Keberhasilan radioterapi dan kemoterapi berasosiasi dengan perubahan eksistensi (menurun dan hilang) EBV-DNA dalam jaringan tumor, sel darah dan serum/plasma, serta perubahan ekspresi gen virus dalam jaringan tumor dan sel darah. 2. Faktor genetik host diduga berkontribusi pada potensi onkogenik EBV pada epitel nasofaring. Mutasi gen Polymeric immunoglobulin receptor (PIGR) 1739C T dan polimorfisme gen reseptor sel T(TCR) mungkin merupakan faktor predisposisi yang menentukan prognosis penyakit.

5 3. Faktor lingkungan mempengaruhi patogenesis KNF : variasi EBV berasosiasi dengan progresivitas dan morbiditas KNF pola hidup – kebiasaan makan bahan diawetkan dan mengandung nitrosamin meningkatkan resiko (rentan) terkena KNF variasi / polimorfisme gen yang mengkode enzim untuk metabolisme nitrosamin (CYP2E1) berasosiasi dengan kerentanan individu terkena/ menderita KNF.

6 Masalah Penelitian Mengkonfirmasi/membuktikan konsistensi KNF dengan infeksi EBV Mendeteksi perubahan eksistensi DNA EBV di dalam darah & saliva pasien KNF sebelum dan sesudah radioterapi dan kemoterapi. 4. Mengidentifikasi mutasi gen PIGR 1793CT pada penderita KNF  membuktikan hubungan mutasi tsb dengan suseptibilitas individu terhadap infeksi EBV dan kerentanannya mendapat KNF.

7 5. Mendeterminasi alel TCRβ dan distribusinya di dalam populasi Indonesia  membuktikan hubungan polimorfismeTCR  dengan suseptibilitas individu terhadap infeksi EBV dan kerentanannya mendapat KNF Mendeteksi mutasi gen LMP1 EBV pada penderita KNF di Indonesia dan hubungannya dengan patogenesis KNF Menganalisa polimorfisme CYP2E1 dan hubungan nya dengan kebiasaan/pola hidup dan patogenesis KNF di Indonesia.

8 Subtopik Penelitian 1. Polimorfisme gen TCR  pada penderita karsinoma nasofaring (KNF) dengan latar belakang etnis berbeda. Oleh : Heru Setiawan, mahasiswa S2 Biomedik /2005. Lulus ujian magister Biomedik pada April  cum-laude. 2. Polimorfisme gen CYP2E1 : hubungannya dengan suseptibilitas individu terhadap karsinoma nasofaring (KNF) pada populasi Indonesia. Oleh : Bhintarti Suryohastari, mahasiswa S2 Biomedik /2005. Lulus ujian magister Biomedik pada Juni  sangat memuaskan.

9 3. Delesi 30 pb gen LMP1 virus Epstein-Barr (EBV) pada penderita karsinoma nasofaring (KNF) di Indonesia. Oleh : Sri Murni Asih, mahasiswa S2 Biomedik / Akan menempuh ujian magister Biomedik bulan Oktober Polimorfisme gen TCR  dan mutasi gen PIGR pada penderita karsinoma nasofaring (KNF) di Indonesia Relevansinya dengan prognosis penyakit, radioterapi dankemoterapi Oleh : Yurnadi, mahasiswa S3 Biomedik Akan mempresentasikan seminar hasil penelitian bulanSeptember 2008.

10 Metodologi Penelitian
Deteksi PIGR 1739 C  T Analisis polimorfisme limfosit T/ TCR  Isolasi DNA genom & serum PCR/RFLP Darah, saliva & biopsi tumor dari penderita KNF dan kontrol sehat Nested PCR Deteksi DNA EBV dan varian EBV (LMP1) Isolasi MNC & sel tumor Isolasi RNA RT-PCR Deteksi ekspresi gen laten dan gen litik EBV

11 Polimorfisme gen TCR   Dideterminasi dengan PCR-RFLP menggunakan enzim restriksi Bgl II.  Dipresentasikan oleh 2 alel : fragmen DNA tidak terpotong Bgl II  alel a fragmen DNA terpotong Bgl II  alel b  Genotip & Alotip TCR  terdistribusi secara bebas menurut Hk. Mendel di dalam populasi.

12 Hasil Elektroforesis amplikon DNA TCR (229 bp) sebelum dipotong
1 2 3 4 5 6 7 8 9 Hasil Elektroforesis amplikon DNA TCR (229 bp) sebelum dipotong dengan enzim restriksi Bgl II dari 9 pasien KNF (Agarose 1%)

13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Marker bb ab bb aa ab aa ab bb bb Hasil Elektroforesis amplikon DNA TCR (229 bp) setelah dipotong dengan enzim restriksi Bgl II dari 9 pasien KNF (Agarose 2%)

14 Tabel I. Distribusi genotip dan frekuensi alel TCR  pada pasien KNF dan kontrol sehat.
Kelompok Total Genotip Frekuensi Alel aa ab bb a (%) b (%) KNF 102 13 39 50 31,86 68,14 Kontrol 106 6 40 60 24,53 75,14 0,10 > P > 0,05

15 Kelompok Total Genotip Frekuensi Alel
Tabel 2. Distribusi genotip dan frekuensi alel TCR  pada populasi Indonesia asli dan etnis Cina di Indonesia. Kelompok Total Genotip Frekuensi Alel aa ab bb a (%) b (%) Indonesia Asli 172 18 63 91 28,78 71,22 Cina 36 1 16 19 25,00 75,00 P > 0,05

16 Kesimpulan 1. Frekuensi alel TCR  pada KNF tidak berbeda nyata dengan kontrol sehat pada P > 0,05 tetapi berbeda nyata pada P < 0,10. ( 0,10 > P > 0,05 ) dimana alel a cenderung meningkat pada pasien KNF  alel a berpredisposisi pada patogenesis KNF Frekuensi alel TCR  pada etnis Cina di Indonesia tidak berbeda nyata dengan yang terjadi pada populasi Indonesia asli  etnis Cina di Indonesia mempunyai resiko terkena KNF sama besar dengan Indonesia asli. Telah terjadi transmisi gen secara bebas antara etnis Cina dan Indonesia asli selama beberapa generasi.

17 Mutasi & polimorfisme gen PIGR  Dideteksi dengan PCR-RFLP menggunakan enzim Hga I.  Dipresentasikan oleh 2 alel fragmen DNA tidak terpotong Hga I  alel T fragmen DNA terpotong Hga I  alel C  Genotip & alotip PIGR terdistribusi secara bebas menurut Hk. Mendel di dalam populasi.

18 Hasil Elektroforesis amplikon DNA PIGR (220 bp) sebelum dipotong
1 2 3 4 5 Hasil Elektroforesis amplikon DNA PIGR (220 bp) sebelum dipotong dengan enzim restriksi Hga I dari 9 pasien KNF (Agarose 1%)

19 Hasil elektroforesis produk PCR-RFLP DNA PIGR pada agarosa 2% selama 60 menit yang divisualisasikan dengan UV iluminatordan kamera polaroid. Menggambarkan genotip pasien KNF CC, TT, dan CT.

20 Tabel 1. : Perbandingan distribusi genotip dan frekuensi alel PIGR
antara kelompok KNF dan Kontrol Kelompok Total TT CT CC Frekuensi Alel T (%) C (%) KNF 102 30 70 2 63,73 36,27 Non KNF 106 33 69 4 63,68 36,32

21 Tabel 5. Frekuensi alel PIGR pada kontrol sehat dan pasien karsinoma
nasofaring (KNF) di Jakarta dan di Thailand (Hirunsatit, 2003)

22 Kesimpulan Prevalensi alel C PIGR cenderung menurun pada KNF, meskipun secara statistik tidak bermakna. Prevalensi alel C dan alel T pada populasi Indonesia tidak sama dengan populasi di Thailand, diduga hal ini disebabkan oleh distribusi geografis.  

23 Polimorfisme gen CYP2E1  CYP2E1adalah enzim yang bekerja pada metabolisme nitrosamin, agen pemicu karsinogenesis (KNF).  Polimorfisme gen CYP2E1 dideterminasi dengan PCR- RFLP menggunakan enzim Dra I.  Polimorfisme gen CYP2E1 direpresentasikan oleh alel : - fragmen DNA dengan 2 situs nonpolimorfik Dra I  alel C - fragmen DNA dengan 2 situs nonpolimorfik dan situs polimorfik Dra I  alel D

24 HASIL PENELITIAN Hasil Amplifikasi Gen CYP2E1
3 4 5 M 1000 pb 995 pb 500 pb Diperolehnya pita DNA berukuran 995 pb mengindikasikan hasil positif untuk dilanjutkan pemotongan DNA tersebut dengan enzim restriksi DraI

25 HASIL RFLP RFLP : (situs restriksi DraI pada TTT’AAA)
M 4 5 6 7 8 500 pb 572 pb 200 pb 121 pb 302 pb 100 pb 874 pb DD DC CC RFLP : (situs restriksi DraI pada TTT’AAA) Pita homozygot variant (CC) = 995 pb  terpotong pada 874 dan 121 pb. (2pita) Pita heterozygot (DC) = 874 pb, 572 pb, 302 bp dan 121 pb. (4 pita) Pita homozigot wildtype (DD) = 572 pb, 302 bp dan 121 pb. (3 pita)

26 KNF : KONTROL Tabel 4. Perbandingan distribusi genotip dan alotip gen CYP2E1 pada kelompok KNF dan Kontrol. Distribusi genotip DD : DC :CC pada kelompok KNF dan Kontrol = 70% : 4% :26% dan 70% : 2% : 28%. Distribusi alotip D : C pada kelompok KNF dan Kontrol adalah 83%:17% dan 84% :16%

27 SUKU SUNDA : NON SUNDA PADA KELOMPOK KNF ----------------------------------------------------
Tabel 6. Perbandingan distribusi genotip dan alotip gen CYP2E1 pada populasi suku Sunda dengan non-Sunda pada kelompok penderita KNF. Distribusi genotip DD:DC:CC = 62,5% : 31,3% : 6,2% dan 73,5% : 23,5% : 3%.

28 KESIMPULAN Frekuensi alel C pada suku Sunda cenderung lebih tinggi daripada non-Sunda (0,05 < p<0,10). Genotip dan alotip CYP2E1 tidak berhubungan dengan kerentanan individu terhadap KNF. 3. Perbandingan distribusi alotip D : C antara kelompok KNF dan kelompok Kontrol adalah tidak ada perbedaan secara bermakna.

29 Variasi gen LMP1 EBV  LMP1 adalah gen laten yang diexpresikan sel tumor KNF dan sel B immortal, mengkonservasi virus menjadi persisten didalam sel.  Varian delesi 30 pb gen LMP1 diduga berkaitan dengan patogenesis KNF  dideterminasi dengan nested PCR menggunakan primer hasil disain sendiri.  Delesi 30 pb gen LMP1 dikonfirmasi dengan sikuensing DNA hasil PCR.

30 Hasil PCR gen LMP1 dengan primer outer, dielektroforesis pada gel agarose 2% dan direkam dengan film polaroid

31 500 pb 162 pb 132 pb Gambaran elektroforesis hasil PCR kedua dengan menggunakan primer inner. Keterangan : kolom 1: DNA ladder tiap 100 pb; kolom 2: sampel no.25 sebagai kontrol untuk 162 pb; kolom 3: sampel no.34 sebagai kontrol untuk 132 pb; kolom 4: kontrol negatif; kolom 5-9: sampel no. 23, 24, 29, 30, dan 41.

32 Hasil sekuensing sampel no. 25

33 Kesimpulan : 1. Di Indonesia, khususnya Jakarta delesi 30 pb gen LMP1 EBV pada pasien KNF ditemukan dengan frekuensi kecil (8%). Beberapa pasien mengalami koeksistensi varian dan wild type. 2. Delesi 30 pb gen LMP1 EBV tidak terbukti berkaitan dengan patogenesis KNF.

34 Terima Kasih