Asetil-CoA Karboksilase

Presentasi berjudul: "Asetil-CoA Karboksilase"— Transcript presentasi:

1 Asetil-CoA Karboksilase
Kusniar Deny Permana

2 Fungsi Acetyl-CoA carboxylase merupakan enzim yang berfungsi untuk mengkatalisis reaksi pembentukan malonyl-CoA.

3 Mekanisme Reaksi

4 Isolasi Enzim ini dapat diisolasi dari berbagai tumbuhan Jurnal :
Enzim diisolasi dari Cyclotella cryptica

5 Materials and Methods Kondisi Pertumbuhan Bahan Metode Analitis
Elektroforesis Penentuan Aktivitas Acetyl-CoA carboxylase Perparation of Cell-Free Extract Pemurnian Fraksinasi Kromatografi Gel Filtrasi Kromatografi Afinitas

6 Kondisi Pertumbuhan Cyclotella cryptica strain T13L diperoleh dari Culture Collection of Marine Phytoplank-ton di Bigelow Laboratory for Ocean Science Sell dikultur dalam botol berisi 2L polikarbonat Kultur diberi gelembung 0,5% CO2 di udara (500 mL/menit) dan dijaga pada suhu 25 oC dibawah iluminasi konstan dari lampu fluorescence

7 Bahan Haloxyfop dan clethodim analytical grade

8 Metode Analisis Protein diukur secara kuantitatif dengan metode Coomasie blue dye-binding (Bio-Rad) menggunakan y-globulin sapi sebagai standar Radioaktivitas ditentukan dengan liquid scintillation counting dengan Beckman model LS9000 scintillation counter, menggunakan H#routine untuk quench correction Biofluor dan Optifluor digunakan sebagai scintillation cocktail

9 Elektroforesis SDS-PAGE 7,5% digunakan sebagai gel pemisah
Protein dipindahkan ke membran nitroselulosa dengan perangkat semidry electroblotting menggunakan sistem buffer dari Shafer-Nielsen et al Protein dideteksi dengan prosedur Bio-Rad Biotin-Plot Protein yang mengandung biotin dideteksi dengan prosedur yang sama

10 Penentuan Aktivitas Aktivitas asetil-CoA diukur dengan penggabungan [14C] bikarbonat dengan asam dan malonil-CoA yang stabil panas Campuran hasil reaksi (0,3 mL) mengandung 100 mm buffer Tricine (pH 8,2), 0,5 mL asetil-CoA, 1 mm ATP, 2mM MgCl2, 10 mmKCl dan 10 mM [14C] NaHCO3 (aktivitas spesifik 11,1 MBq/ mmol) Reaksi diinisiasi oleh penambahan enzim dan diterminasi setelas 10 menit pada suhu 30oC dengan penambahan 0,3 mL HCl 2N.

11 Cell-Free Extract Sel disentrifuga pada 5000 g selama 5 menit dan dicuci dengan buffer MCD Sel disimpan dalam mL buffer MCD Sel dilewatkan pada French pressure cell pada psi Pressate disentrifuga g selama 20 menit Supernatan dilarutkan dalam MCD hingga konsentrasi proteinnya 5 mg/mL Semua langkah di atas dilakukan pada suhu 4oC

12 Pemurnian Fraksinasi Kromatografi gel filtrasi Kromatografi afinitas

13 Fraksinasi (NH4)2SO4 jenuh ditambahkan pada crude extract dengan pengadukan untuk menghasilkan larutan dengan kejenuhan 30% Larutan disentrifuga pada 8000 g selama 5 menit Pellet dibuang, supernatan secara bertahap ditambahkan (NH4)2SO4 sampai kejenuhan 43, 50 dan 60% Semua endapan dibuang kecuali yang terakhir. Endapan dilarutkan dalam 5-10 mL buffer MCD dan akan digunakan pada tahap berikutnya

14 Kromatografi Gel Filtrasi
Larutan hasil fraksinasi dimasukkan ke dalam kolom 90x2,2 cm Biogel A-1,5 m (Bio-Rad) Kolom dielusi dengan buffer MCD dengan laju alir 20 mL/jam.

15 Kromatografi Afinitas
Asetill-CoA karboksilase dielusi dalam kolom dengan menggunakan buffer MKD yang mengandung 0,5 g biotin/mL

16 HASIL

17 Uji Aktivitas Setelah dilakukan tahap pemurnian, didapatkan enzim dengan aktivitas 14,6 μmol malonil-CoA/mg protein/menit Terjadi peningkatan aktivitas spesifik sekitar 600 kali lipat.

18 Kromatografi Gel Filtrasi
SDS-PAGE Berat molekulnya 740 kD Berat molekulnya 185 kD

19 Stabilitas dan Aktivitas
Enzim ini memiliki pH basa optimum pada pH 8,2 tetapi stabilitas maksimum pada pH 6,5 Pada tahap fraksinasi pada pH 6,5 setelah 48 jam, enzim menunjukkan 97% aktivitas Sedangkan pada pH 7,5 dan 5,5 hanya tersisa 15% dan 4%.

20 Stabilitas dan Aktivitas
Enzim mengalami penurunan aktivitas tanpa adanya sulfuhydryl reductant Adanya sitrat menstabilkan enzim ini Enzim membutuhkan NaCl atau KCL untuk stabilitasnya. Aktivitas enzim bergantung pada kation logam divalen, misalnya Mg2+ maksimum pada konsentrasi 2 mM.