Oleh Rosmaya Dewi Nurul Widya

Presentasi berjudul: "Oleh Rosmaya Dewi Nurul Widya"— Transcript presentasi:

1 Oleh Rosmaya Dewi 20511309 Nurul Widya 20511312
α-Amilase (EC ) Oleh Rosmaya Dewi Nurul Widya INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2012

2 Agenda Presentasi Struktur dan Tatanama α-Amilase Kegunaan α-Amilase
Mekanisme Katalisis α -Amilase Isolasi α-Amilase Modifikasi α-Amilase

3 Struktur α–Amilase domain A domain B domain C Domain A memiliki struktur tong (β/α)8 yang terdiri dari delapan untai β yang paralel dikelilingi oleh delapan heliks α terletak di antara β3 dan α3. Pada domain ini terdapat ion Ca2+. yang berperan untuk mengikat substrat merupakan β-sheet anti paralel yang memiliki peran sebagai pelindung residu hidrofobik pada domain A. Pada domain ini terdapat tiga residu katalitik, yaitu dua residu asam aspartat dan satu asam glutamat yang terletak pada untai β4, β5, dan β7. Domain B α-amilase terletak di antara β3 dan α3. Pada domain ini terdapat ion Ca2+. yang berperan untuk mengikat substrat. Domain C α-amilase yang merupakan β-sheet anti paralel yang memiliki peran sebagai pelindung residu hidrofobik pada domain A.

4 Tata nama α–Amilase endoenzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis ikatan α-1,4 gliosidik pada pati dan glikogen dengan produk akhir berupa dekstrin dan oligosakarida (van der Maarel et al., 2002) α-Amilase (EC ) Digit keempat: nomor urut 1 α-Amilase (EC ) merupakan endoenzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis ikatan α-1,4 gliosidik pada pati dan glikogen dengan produk akhir berupa dekstrin dan oligosakarida (van der Maarel et al., 2002). Digit pertama: 3, menunjukkan kelas hidrolase. Digit kedua: 2, menunjukkan ikatan yang dihidrolisis adalah ikatan glikosidik (glikosilase). Digit ketiga: 1, menunjukkan enzim yang menghidrolisis senyawa O- dan S-glikosil. Digit keempat: 1, menunjukkan nomor urut 1. digit pertama kelas hidrolase Digit ketiga: enzim yang menghidrolisis senyawa O- dan S-glikosil digit kedua ikatan yang dihidrolisis adalah ikatan glikosidik (glikosilase).

5 α-Amilase α-Amilase (EC ) merupakan enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis ikatan α-1,4 gliosidik pada pati dan glikogen dengan produk akhir berupa dekstrin dan oligosakarida (van der Maarel et al., 2002). α-Amilase merupakan enzim amilolitik yang berfungsi untuk mempercepat laju reaksi degradasi bagian linear pati

6 Kegunaan α-Amilase industri bioetanol untuk memecah pati menghasilkan oligosakarida dan dekstrin industri deterjen, untuk meningkatkan kemampuan deterjen dan menjadikan deterjen lebih ramah lingkungan untuk memodifikasi pati dari kertas industri kertas dan pulp, industri pemrosesan pati menjadi oligosakarida dan sirup glukosa α-amilase paling banyak digunakan pada industri pemrosesan pati menjadi oligosakarida dan sirup glukosa Pada industri bioetanol, enzim α-amilase digunakan untuk memecah pati menghasilkan oligosakarida dan dekstrin Pada industri kertas dan pulp, α-amilase digunakan untuk memodifikasi pati dari kertas yang terlapisi agar permukaan kertas cukup halus dan kuat sehingga meningkatkan Pada industri deterjen, enzim α-amilase berguna untuk meningkatkan kemampuan deterjen dan menjadikan deterjen lebih ramah lingkungan

7 Mekanisme Katalitik α-Amilase
Mekanisme katalitik α-amilase disebut dengan α-retaining double displacement Mekanisme ini melibatkan dua residu katalitik pada sisi aktif; residu asam glutamat sebagai asam/basa katalis dan residu asam aspartat sebagai nukleofil

8 5 Tahap Katalitik α -Amilase
setelah substrat terikat pada sisi aktif, residu asam glutamat dalam bentuk asamnya mendonorkan sebuah proton pada oksigen ikatan glikosidik, oksigen antara dua molekul glukosa pada bagian -1 dan +1 dan nukleofilik dari residu asam aspartat menyerang C1 dari glukosa pada bagian -1 Tahap 2 Terbentuknya sebuah ion oksokarbonium pada keadaan transisi yang diikuti dengan pembentukan kovalen intermediet Tahap 3 Molekul glukosa yang terprotonasi pada bagian +1 meninggalkan sisi aktif saat molekul air atau molekul glukosa baru pindah pada sisi aktif dan menyerang ikatan kovalen diantara molekul glukosa pada bagian -1 dan residu asam aspartat; Lima tahap yang terlibat pada mekanisme katalitik ini adalah : setelah substrat terikat pada sisi aktif, residu asam glutamat dalam bentuk asamnya mendonorkan sebuah proton pada oksigen ikatan glikosidik, oksigen antara dua molekul glukosa pada bagian -1 dan +1 dan nukleofilik dari residu asam aspartat menyerang C1 dari glukosa pada bagian -1; Terbentuknya sebuah ion oksokarbonium pada keadaan transisi yang diikuti dengan pembentukan kovalen intermediet;

9 5 Tahap Katalitik α –Amilase (con’t)
. Tahap 4 Ion oksokarbonium terbentuk kembali Tahap 5 Basa katalis residu asam glutamat menerima sebuah hidrogen dari air yang datang atau dari molekul glukosa baru pada bagian +1 dan menggantikan ikatan oksokarbonium diantara molekul glukosa pada bagian -1 dan residu asam aspartat membentuk gugus hidroksil baru pada posisi C1 dari glukosa pada bagian -1 (hidrolisis) atau ikatan glikosidik baru diantara glukosa pada bagian -1 dan +1 (transglikosilasi) (Gambar 3). Residu asam aspartat katalitik kedua berperan mengatur distorsi substrat dan pKa residu asam glutamat katalitik melalui interaksi elektrostatik Molekul glukosa yang terprotonasi pada bagian +1 meninggalkan sisi aktif saat molekul air atau molekul glukosa baru pindah pada sisi aktif dan menyerang ikatan kovalen diantara molekul glukosa pada bagian -1 dan residu asam aspartat; Ion oksokarbonium terbentuk kembali; Basa katalis residu asam glutamat menerima sebuah hidrogen dari air yang datang atau dari molekul glukosa baru pada bagian +1 dan menggantikan ikatan oksokarbonium diantara molekul glukosa pada bagian -1 dan residu asam aspartat membentuk gugus hidroksil baru pada posisi C1 dari glukosa pada bagian -1 (hidrolisis) atau ikatan glikosidik baru diantara glukosa pada bagian -1 dan +1 (transglikosilasi) (Gambar 3). Residu asam aspartat katalitik kedua berperan mengatur distorsi substrat dan pKa residu asam glutamat katalitik melalui interaksi elektrostatik

10 Isolasi gen α-Amilase B. aquimaris MKSC 6.2
Isolasi gen α-Amilase B. aquimaris MKSC 6.2 dengan : Teknik Degenerate PCR dan Inverse PCR Tahap isolasi secara umum : 1. Preparasi Enzim 2. Pengujian Enzim Berikut adalah salah satu cara isolasi enzim α-amilase yang berasal dari Bacillus aquimaris MKSC 6.2 yang terasosiasi dengan karang lunak Sinularia sp (Puspasari, et al., 2011) : Preparasi Enzim Untuk memurnikan enzim α-amilase, strain B. aquimaris ditumbuhkan dalam 100 mL Marine Broth (MB: 0,25% b/v pepton, dan 0,15% b/v ekstrak ragi dalam 50% v/v air laut) yang mengandung 0,005% b/v pati beras pada 300C dengan rotary shaker (150 rpm) selama 24 jam. Kerapatan sel ditentukan dengan mengukur OD pada 600 nm. Sel dikeluarkan dengan sentrifugasi (6000 x g, 20 min) dan supernatan kultur diendapkan dengan 0-70% amonium sulfat jenuh. Endapan didialisis terhadap 20 mM buffer Tris-HCl (pH 7,0). Fraksi amonium sulfat ini digunakan untuk studi lebih lanjut.

11 Teknik Isolasi gen α-Amilase B. aquimaris MKSC 6.2
Degenerate PCR Inverse PCR Degenerate PCR mempunyai banyak kesamaan dengan PCR biasa. Perbedaan utamanya adalah primer spesifik pada PCR biasa diganti dengan primer mix. Banyak gen dalam satu famili mempunyai struktur yang mirip. Dengan menderetkan sekuens nukleotida dari sejumlah nukleotida yang berhubungan akan dapat ditemukan bagian nukleotida yang konserf (conserve). Berdasarkan informasi tersebut dapat ditemukan motif nukleotida yang konserf yang dapat digunakan sebagai titik awal pembuatan primer degenerate PCR (Koelle, 1996) Inverse PCR umumnya digunakan untuk mengidentifikasi urutan mengapit sekitar sisipan genom yang melibatkan serangkaian digestions DNA dan ligasi diri, sehingga urutan dikenal di kedua ujung urutan diketahui Pengujian Enzim Aktivitas α-amilolitik ditentukan dengan mengukur jumlah gula tereduksi yang dibentuk dengan menggunakan modifikasi metode dinitrosalicylic acid (DNS) dengan glukosa sebagai standar kalibrasi. Pengujian amilase dilakukan selama 10 menit dalam 50 mL campuran reaksi yang terdiri dari 25 mL 1% soluble pati dan 25 µL enzim encer yang sesuai dalam 50 mM penyangga universal (asam suksinat/NaH2PO4/glisin) pH 6,5 pada 500C. Aktivitas ini dihentikan dengan penambahan 50 µL larutan DNS (1% b/v DNS, 0,4 M NaOH, dan 30% b/v K-Na-tartrat). Campuran reaksi kemudian diinkubasi dalam bak air mendidih selama 10 menit. Selanjutnya, campuran reaksi didinginkan kembali sampai mencapai suhu kamar dan diukur absorbansi pada 500 nm. Semua tes dilakukan rangkap tiga. Konsentrasi protein ditentukan dengan metode Bradford menggunakan BSA sebagai standar (BioRad protein assay).

12 Modifikasi α-amilase pada industri pengolahan pati
Hidrolisis pati : gelatinisasi suhu ↑, biaya ↑ -Amilase pendegradasi pati mentah: biaya ↓, menyederhanakan proses konversi pati (puspitasari, 2011)

13 Referensi Pandey, A., Nigam, P., Soccol, C. R., Soccol, V. T.,Sing, D., dan Mohan, R., (2000), Advances in Microbial Amylases. Biotechnology and Applied Biochemistry. 31,135–152 Puspasari, F., Nurachman, Z., Noer Saefuddin, A., Natalia, D. (2011). Characteristic of raw starch degrading α-amylase from Bacilllus aquimaris MKSC 6.2 associated with soft coral Sinularia sp., Starch-Starke Van der Maarel,M.J.E.C., van der Veen,B., Uitdehaag, J.C. M.,leemhuis,H., Dijkhuizen, L. (2002). Properties and application of starch converting enzymes of the amylase family, Journal of Biotechnol