Pengristalan protein.

Presentasi berjudul: "Pengristalan protein."— Transcript presentasi:

1 Pengristalan protein

2 Langkah penentuan struktur
Penyiapan sampel murni Pembuatan kristal Pengumpulan data kristalografi Pembuatan dan penyelesaian model struktur Analisis struktur

3

4

5 Pengristalan Kristal tunggal → analisis struktur XRD
Kalau perlu dalam gravitasi mikro Prosedur coba-coba (trial and error) Makin murni protein, makin baik kesempatan menumbuhkan kristal Syarat lain protein: memiliki sifat permukaan yang sama (muatan yang sama) → untuk pengemasan molekul dalam kristal)

6 Tahap penting pengristalan
Penentuan kemurnian protein Pelarutan protein dalam pelarut yang cocok → dengan garam atau pelarut organik (untuk protein membran perlu deterjen) Pengkondisian superjenuh untuk pembentukan inti kristal → pembentukan agregat kecil Pertumbuhan kristal → pengikatan molekul baru pada permukaan inti krital

7 Kurva kelarutan protein

8 Pengendapan protein Melalui penambahan garam, PEG, atau pelarut organik Garam: salting out (pelemahan gaya tolak dan dehidarasi permukaan protein) PEG: menarik air dan mengimobilisasi air Pelarut organik: efek elektrostatik (gaya elektrostatik ~ 1/tetapan dielektrik) Melalui pengubahan pH dan suhu

9 Berapa gram protein? Ukuran kristal yang umum: 0,2 × 0,2 × 0,2 mm (0,008 mm3 atau sekira 10 µg protein) 1 mg protein → 100× percobaan Pretein membran sangat sulit dikristalkan Cara lama penambahan detergen Cara lain: fase kubus lipid sebagai matriks pengristalan protein

10 Teknik pengristalan Metode batch Difusi cair-cair Difusi uap Dialisis
Tetes menggantung Tetes duduk Dialisis

11

12 Contoh: kristalisasi fosfolipase A membran luar
Hanging-drop vapour diffusion Protein solution: 8 mg/ml OMPLA 1,5% -oktil-glukosida 10 mM buffer suksinat, pH 6,5 1 mM NaN3 Reservoir solution: 25-29% 2-metil,2,4-pentanediol 1 mM CaCl2 0,1 M Bis-Tris pH 6.0

13 Kristal amilase Protein: 10 mg/ml
40% PEG mM CaCl2 50 mM NaCl 100 mM MES pH 6.5 40% PEG mM Ca-asetat 100 mM cacodylate pH 6.5, 40% PEG mM MES, pH mM CaCl2 25 mM NaCl

14 Kristal ABS (fragmen FBP)
Tetes: 1 ml ABS (9.0 mg/ml) + 1 ml lar pengendap, pada 20oC Larutan pengendap: 0.1 M NaAc pH 4.6, 1.5% PEG1500 Kristal batang Tumbuh setelah 4 hari (ukuran 300 × 2 × 2 µm)

15 Catatan awal kristal Muka datar (merefleksikan kemasan teratur molekul, ion, atau atom) Periksa dengan mikroskop pemolarisasi

16 Persiapan percobaan XRD
Kristal: 40–60% berisi air/pelarut Keuntungan: dapat melakukan reaksi dalam kristal Kerugian: labil karena air mudah menguap Cryo (100–120 K, N2 cair) →perlu cryoprotectant Mounting kristal Letak pada kepala goniometer Amati data osilasi sekira 0,15o Ambil data hingga 3o

17

18 Persamaan Bragg: 2 d sin θ = λ

19 Difraksi

20 Difraksi dalam 3D

21 Catatan Pengristalan: tahap utama dalam XRD No crystal no structure
Mounting kristal: perhatikan ketebalan kapiler Pola sinar-X (sinar terdifraksi sering disebut refleksi)