第九章 植物体细胞无性系变异 及种质资源保存. 一、概念 LarkinScowcroft （ 1981 ）提出把由任何形式的 细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系 （ somaclones ）。LarkinScowcroft （ 1981 ）提出把由任何形式的 细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系.

Presentasi berjudul: "第九章 植物体细胞无性系变异 及种质资源保存. 一、概念 LarkinScowcroft （ 1981 ）提出把由任何形式的 细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系 （ somaclones ）。LarkinScowcroft （ 1981 ）提出把由任何形式的 细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系."— Transcript presentasi:

1 第九章 植物体细胞无性系变异 及种质资源保存

2 一、概念 LarkinScowcroft （ 1981 ）提出把由任何形式的 细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系 （ somaclones ）。LarkinScowcroft （ 1981 ）提出把由任何形式的 细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系 （ somaclones ）。 在培养阶段发生变异，进而导致再生植株亦发 生遗传改变的现象，称为体细胞无性系变异 （ somaclonal variation ）。 在培养阶段发生变异，进而导致再生植株亦发 生遗传改变的现象，称为体细胞无性系变异 （ somaclonal variation ）。 第一节 植物体细胞无性系变异的概念及筛选

3 二、变异主要涉及两个方面： 表型变异  包括形态特征、生长习性、抗性等 染色体变异  数目、结构

4 三、体细胞变异的优缺点： 优点：  适用于各种组培植物；  持续快速提供变异源；  消除优良品种的一个或几个缺陷；  提供新型变异株系。 缺点：  继代多次后，植株再生能力减弱；  变异不稳定，杂交或自交后发生变化；  变异没有可预见性，常产生不适变异。

5 四、体细胞无性系变异的诱导与离体筛选 体细胞无性系变异的筛选有以下明显的优点： －可以小空间内对大量个体进行选择； －筛选可以在几个细胞周期内完成，且不受季节限制； －诱变和筛选条件可精确控制，试验重复性好； －突变体来源于单细胞，避免了植株出现嵌合体； －在细胞培养系统中，诱变剂可较均匀地接触细胞，突 变率高，选择机会多。

6 步骤： 诱变材料的选择 突变体筛选 细胞诱变自发变异 突变体稳定性鉴定

7 （一）诱导起始材料的选择 选择 起始 材料 原则 目标性状 的可行性 试验植物 细胞培养 技术水平 适当的 细胞类型

8 （二）自发突变 一般来讲，长期营养繁殖的植物、培养时间较 长或继代次数多等，均容易出现较高的变异率。另 外，培养类型中，原生质体、细胞、愈伤组织培养 等所出现的变异频率要高于组织或器官培养的变异。 一般来讲，长期营养繁殖的植物、培养时间较 长或继代次数多等，均容易出现较高的变异率。另 外，培养类型中，原生质体、细胞、愈伤组织培养 等所出现的变异频率要高于组织或器官培养的变异。

9 （三）诱变 物理诱变 化学诱变 转座子插入

10

11 化学诱变常用的化学诱变剂： - 烷化剂如 DES ，可改变 DNA 结构而引起突变； - 烷化剂如 DES ，可改变 DNA 结构而引起突变； - 碱基类似物，核酸复制时，可掺入到新 - 碱基类似物，核酸复制时，可掺入到新 合成的 DNA 分子中引起错配； 合成的 DNA 分子中引起错配； - 移码诱变剂，如 ICR 化合物。 - 移码诱变剂，如 ICR 化合物。

12 转座子插入诱变 转座子插入诱变是近年来利用分子生物学技术发 展起来的新的体细胞诱变方法。转座子既可直接 将外源基因带入细胞内获得新性状，又可以独立 插入通过其转座功能诱导变异。 转座子插入诱变是近年来利用分子生物学技术发 展起来的新的体细胞诱变方法。转座子既可直接 将外源基因带入细胞内获得新性状，又可以独立 插入通过其转座功能诱导变异。 目前，使用较多的转座子体系是玉米的 Ac/Ds 系统。首先 采用基因转化的方法将 Ac/Ds 导入受体细胞，再通过体细 胞培养或再生植株的自交或测交使 Ac 因子切除，由于转座 子插入的随机性，即可在切除 Ac 的植株中筛选出不同变异。 利用这一途径已在苜蓿、马铃薯、番茄、甘蓝等多种植物 上获得可利用的体细胞变异植株。 目前，使用较多的转座子体系是玉米的 Ac/Ds 系统。首先 采用基因转化的方法将 Ac/Ds 导入受体细胞，再通过体细 胞培养或再生植株的自交或测交使 Ac 因子切除，由于转座 子插入的随机性，即可在切除 Ac 的植株中筛选出不同变异。 利用这一途径已在苜蓿、马铃薯、番茄、甘蓝等多种植物 上获得可利用的体细胞变异植株。

13 （四）突变体选择 直接筛选间接筛选

14 直接选择 直接选择 其方法是用一种含有特定物质的选择培养基，在 此培养基上只有突变细胞能够生长，非突变细胞 不能生长，从而直接筛选出突变性。 其方法是用一种含有特定物质的选择培养基，在 此培养基上只有突变细胞能够生长，非突变细胞 不能生长，从而直接筛选出突变性。 贾敬芬等以小麦幼胚愈伤组织为材料，在含有 1.4%NaCl 的 N6 培养基上直接筛选出小麦耐盐系。 贾敬芬等以小麦幼胚愈伤组织为材料，在含有 1.4%NaCl 的 N6 培养基上直接筛选出小麦耐盐系。 郑企成等曾将小麦 “ 京花 1 号 ” 花药经 γ 射线处理后，再经 0.5NaCl 培养基直接筛选出耐盐再生株系。 郑企成等曾将小麦 “ 京花 1 号 ” 花药经 γ 射线处理后，再经 0.5NaCl 培养基直接筛选出耐盐再生株系。

15 间接选择 间接选择 间接选择是一种借助于与突变表现有关的性状 作为选择指标的筛选方法。 间接选择是一种借助于与突变表现有关的性状 作为选择指标的筛选方法。 Dorffling 等以羟脯氨酸（ HYP ）为选择剂，获得了 耐 HYP 的体细胞变异系，其抗寒性比供体亲本增强， 且能稳定遗传。 Dorffling 等以羟脯氨酸（ HYP ）为选择剂，获得了 耐 HYP 的体细胞变异系，其抗寒性比供体亲本增强， 且能稳定遗传。 林定波等将锦橙株心细胞愈伤组织的悬浮细胞经 γ 射线照射，然后在高浓度脯氨酸培养基中培养筛选， 获得了抗寒体细胞变异愈伤组织，其再生植株抗寒 性比供体植株提高 2.4 ℃。 林定波等将锦橙株心细胞愈伤组织的悬浮细胞经 γ 射线照射，然后在高浓度脯氨酸培养基中培养筛选， 获得了抗寒体细胞变异愈伤组织，其再生植株抗寒 性比供体植株提高 2.4 ℃。

16 （五）突变体稳定性鉴定 突变细胞或组织鉴定 突变细胞或组织鉴定 在正常培养基上继代培养几次进行鉴定。 在正常培养基上继代培养几次进行鉴定。 突变植株鉴定 突变植株鉴定 当代鉴定或自交后代鉴定 当代鉴定或自交后代鉴定

17 第二节 影响植物体细胞无性系变异的因素

18 一、供体植物 — 生理状态 以分生组织为外植体的再生植株通常可以 维持供体植物的典型性，体细胞变异频率 很低。 以分生组织为外植体的再生植株通常可以 维持供体植物的典型性，体细胞变异频率 很低。 以分化组织为外植体的再生植株容易发生 体细胞变异，其频率与分化程度有关。 以分化组织为外植体的再生植株容易发生 体细胞变异，其频率与分化程度有关。

19 一、供体植物 — 遗传背景 基因型：植物种基因型间变异频率差异较 大。 基因型：植物种基因型间变异频率差异较 大。 倍性水平：多倍体和染色体数目较多的植 物其变异频率比二倍体和单倍体高。 倍性水平：多倍体和染色体数目较多的植 物其变异频率比二倍体和单倍体高。

20 二、培养基 — 激素 培养基激素浓度和不同激素配比对再生植 株的染色体倍性有一定的影响。 培养基激素浓度和不同激素配比对再生植 株的染色体倍性有一定的影响。 激素引起的变异大多为倍性增加。 激素引起的变异大多为倍性增加。 少数情况下激素引起类减数分裂而使倍性 减少。 少数情况下激素引起类减数分裂而使倍性 减少。

21 二、培养基 — 物理状态 一般来讲，悬浮培养的细胞较半固体培养 的细胞易产生变异。 一般来讲，悬浮培养的细胞较半固体培养 的细胞易产生变异。

22 三、培养类型 原生质体培养的体细胞变异大于细胞培养， 而细胞培养的变异又大于组织器官培养的 变异。在细胞培养中，性细胞培养再生植 株的变异要大于体细胞培养的植株。 原生质体培养的体细胞变异大于细胞培养， 而细胞培养的变异又大于组织器官培养的 变异。在细胞培养中，性细胞培养再生植 株的变异要大于体细胞培养的植株。

23 四、继代次数 由继代次数引起的体细胞变异普遍存在。一般来 说，继代时间越长，继代次数越多，细胞变异的 机率就越高。 由继代次数引起的体细胞变异普遍存在。一般来 说，继代时间越长，继代次数越多，细胞变异的 机率就越高。 －烟草继代培养５年的愈伤组织，其再生植株与供体基 因型相比，几乎没有形态正常的植株。染色体分析表 明其大多为非整倍体和多倍体。 －玉米从刚诱导的愈伤组织中分化的植株，在形态上与 供体基因型基本一致，但培养３年后愈伤组织的再生 能力显著下降，再生植株生长异常。细胞学分析显示 染色体断裂和带型变异。

24 第三节 植物体细胞无性系变异的机理 预先存在的变异表达 预先存在的变异表达 染色体数目变化 染色体数目变化 点突变 点突变 体细胞染色体变换及姐妹染色单体交换 体细胞染色体变换及姐妹染色单体交换 ＤＮＡ复制和缺失 ＤＮＡ复制和缺失 转座因子的活化 转座因子的活化 ＤＮＡ甲基化 ＤＮＡ甲基化

25 第四节 植物体细胞无性系变异的应用 改良作物品种拓宽种质资源 遗传学研究 发育生物学研究 代谢研究 加强外源基因向栽培种的渐渗

26 一、改良作物品种、拓宽种质资源 据统计，诱导突变已被用来改良诸如小麦、 水稻、大麦、棉花、花生和菜豆这些种子繁 殖的重要作物。 据统计，诱导突变已被用来改良诸如小麦、 水稻、大麦、棉花、花生和菜豆这些种子繁 殖的重要作物。 在全世界 50 多个国家中已发放了 1000 多个 由直接突变获得的或由这些突变相互杂交而 衍生的品种。 在全世界 50 多个国家中已发放了 1000 多个 由直接突变获得的或由这些突变相互杂交而 衍生的品种。

27 在各国现有通过体细胞诱变选育的谷类作物品 种中，品质得到不同程度改良的占 34.3% 。 在水稻方面，国外至少育成了 12 个米质优良 的品种。如法国选育的 Delta ，以其良好的 籽粒品质占该国水稻总面积的 20% 。 在水稻方面，国外至少育成了 12 个米质优良 的品种。如法国选育的 Delta ，以其良好的 籽粒品质占该国水稻总面积的 20% 。 此外，还有丹麦无花青素原大麦 Galant 。 此外，还有丹麦无花青素原大麦 Galant 。

28 据不完全统计，诱变品种中大约有 1/4 是抗 病品种，其中 80% 左右为抗真菌品种。 据不完全统计，诱变品种中大约有 1/4 是抗 病品种，其中 80% 左右为抗真菌品种。 耐盐、抗旱、抗寒变异也已筛选出众多中间 材料，有的已进入区域试验，有的已用于生 产。 耐盐、抗旱、抗寒变异也已筛选出众多中间 材料，有的已进入区域试验，有的已用于生 产。

29 二、加强外源基因向栽培种的渐渗 对远缘杂交的体细胞杂种、单体异附加系和 异代换系等材料进行组织培养，能使它们发 生遗传交换，提高外源基因向栽培种渐渗。 对远缘杂交的体细胞杂种、单体异附加系和 异代换系等材料进行组织培养，能使它们发 生遗传交换，提高外源基因向栽培种渐渗。

30 三、遗传学研究 突变体直接用于基因功能鉴定 突变体直接用于基因功能鉴定 突变 DNA 序列用作分子标记进行遗传研究 突变 DNA 序列用作分子标记进行遗传研究 利用突变体策略已分离出一些功能基因和抗病基 因，如玉米乙醇脱氢酶基因 ADH ，赤霉素合成相 关基因、生长素敏感性基因等。 利用突变体策略已分离出一些功能基因和抗病基 因，如玉米乙醇脱氢酶基因 ADH ，赤霉素合成相 关基因、生长素敏感性基因等。

31 四、发育生物学研究 利用体细胞突变策略对植物发育的基因调控 研究已在模式植物拟南芥和金鱼草等植物中 广泛开展，并分离出一大批不同发育阶段和 组织类型的突变体。 利用体细胞突变策略对植物发育的基因调控 研究已在模式植物拟南芥和金鱼草等植物中 广泛开展，并分离出一大批不同发育阶段和 组织类型的突变体。

32 以突变体为工具，还从组织学和细胞学角度分析鉴 定了一些基因的表达与植物发育的关系。 以突变体为工具，还从组织学和细胞学角度分析鉴 定了一些基因的表达与植物发育的关系。 在烟草、玉米中均通过质体突变体分离鉴定了与植 物叶绿体发育有关的核基因。玉米黄化突变体 pun 是一个在光照下不可逆转的突变体，分析显示，该 突变体为一核单基因隐性突变，该基因的突变扰乱 了叶绿体基因编码的蛋白质积累，进而使叶绿体膜 系统发育不足，类囊体相关蛋白不能积累。 在烟草、玉米中均通过质体突变体分离鉴定了与植 物叶绿体发育有关的核基因。玉米黄化突变体 pun 是一个在光照下不可逆转的突变体，分析显示，该 突变体为一核单基因隐性突变，该基因的突变扰乱 了叶绿体基因编码的蛋白质积累，进而使叶绿体膜 系统发育不足，类囊体相关蛋白不能积累。

33 五、代谢途径研究 突变体作为代谢活动调控研究的工具，具有十分 便利和高效的优势。可根据需要建立某一代谢途 径中每一个调节点的突变体，也可以与基因工程 相结合，对一些关键调控过程进行修饰和改造， 使代谢过程按照人类需要进行。因此而发展起来 的新型学科领域称之为代谢工程。 突变体作为代谢活动调控研究的工具，具有十分 便利和高效的优势。可根据需要建立某一代谢途 径中每一个调节点的突变体，也可以与基因工程 相结合，对一些关键调控过程进行修饰和改造， 使代谢过程按照人类需要进行。因此而发展起来 的新型学科领域称之为代谢工程。

34 近年来，通过体细胞突变研究激素、次生代谢产 物等代谢途径的研究已有许多报道。如番茄推迟 成熟的突变体 Nr ，与乙烯应答基因突变有关； 玉米胚乳皱缩型突变 sh 可能涉及蔗糖代谢的相 关酶基因的突变。 近年来，通过体细胞突变研究激素、次生代谢产 物等代谢途径的研究已有许多报道。如番茄推迟 成熟的突变体 Nr ，与乙烯应答基因突变有关； 玉米胚乳皱缩型突变 sh 可能涉及蔗糖代谢的相 关酶基因的突变。

35 小结小结小结小结 细胞工程技术对培养细胞具有遗传稳定性和变异性 的双重影响 细胞工程技术对培养细胞具有遗传稳定性和变异性 的双重影响 体细胞变异在培养类型中具有普遍性，在变异性状 上具有局限性 体细胞变异在培养类型中具有普遍性，在变异性状 上具有局限性 体细胞变异可自发产生也可通过理化因子诱导产生 体细胞变异可自发产生也可通过理化因子诱导产生 体细胞变异包括染色体数量和结构变异，但大多数 可利用变异多为基因突变 体细胞变异包括染色体数量和结构变异，但大多数 可利用变异多为基因突变 利用体细胞变异可以直接培育品种也可作为生物学 相关研究的基础材料 利用体细胞变异可以直接培育品种也可作为生物学 相关研究的基础材料

36 第五节 植物种质资源离体保存

37 概念： 种质资源的离体保存：是指对离体培养的 小植株、器官、组织、细胞或原生质等材 料，采用限制、延缓或停止其生长的处理 使之保存，在需要时可重新恢复其生长， 并再生植株的方法。 种质资源的离体保存：是指对离体培养的 小植株、器官、组织、细胞或原生质等材 料，采用限制、延缓或停止其生长的处理 使之保存，在需要时可重新恢复其生长， 并再生植株的方法。

38 意义： 所占空间少，节省大量的人力、物力和土地； 所占空间少，节省大量的人力、物力和土地； 便于种质资源的交流利用； 便于种质资源的交流利用； 需要时，可以用离体培养方法很快大量繁殖； 需要时，可以用离体培养方法很快大量繁殖； 避免自然灾害引起的种质丢失。 避免自然灾害引起的种质丢失。

39 缺点： 对于限制或延缓生长的处理，需定期转移，连续 继代培养； 对于限制或延缓生长的处理，需定期转移，连续 继代培养； 易受微生物污染或发生人为差错； 易受微生物污染或发生人为差错； 多次继代培养有可能造成遗传性变异及材料和分 化和再生能力的降低。 多次继代培养有可能造成遗传性变异及材料和分 化和再生能力的降低。 超低温保存可在一定程度上避免这些问题。 超低温保存可在一定程度上避免这些问题。

40 两种保存方法： 两种保存方法： 限制生长保存 限制生长保存 超低温保存种质 超低温保存种质

41 限制生长保存 一、低温保存法 一、低温保存法 是限制生长保存中应用最广的方法。培养温度 一般为 1-9 ℃（热带、亚热带植物则一般为 10- 20 ℃ ），同时提高培养基的渗透压，培养物 的生长受到抑制，继代时间可延长间隔数月到 1 年以上。 是限制生长保存中应用最广的方法。培养温度 一般为 1-9 ℃（热带、亚热带植物则一般为 10- 20 ℃ ），同时提高培养基的渗透压，培养物 的生长受到抑制，继代时间可延长间隔数月到 1 年以上。

42 二、高渗透压保存法 二、高渗透压保存法 三、生长抑制（或延缓剂）保存法 三、生长抑制（或延缓剂）保存法 如加入 ABA 、矮壮至少、多效唑等 如加入 ABA 、矮壮至少、多效唑等 四、降低氧分压保存法 四、降低氧分压保存法 五、干燥保存法 五、干燥保存法 对培养物台愈伤或体细胞胚进行脱水处理，然后置 于特定的培养基条件下保存。 对培养物台愈伤或体细胞胚进行脱水处理，然后置 于特定的培养基条件下保存。

43 超低温保存种质 植物超低温种质保存是指将植物的离体材料包 括茎尖（芽）、分生组织、胚胎、花粉、愈伤 组织、悬浮细胞、原生质体等，经过一定的方 法处理后在超低温（ -196 ℃液氮）条件下进行 保存的方法。 植物超低温种质保存是指将植物的离体材料包 括茎尖（芽）、分生组织、胚胎、花粉、愈伤 组织、悬浮细胞、原生质体等，经过一定的方 法处理后在超低温（ -196 ℃液氮）条件下进行 保存的方法。

44 一、超低温保存的基本原理 一、超低温保存的基本原理 离体种质在液氮中几乎所有的细胞代谢活动、生长都 停止，因而排除了遗传性状的变异，同时保存了细胞 的活力和形态发生潜能。 离体种质在液氮中几乎所有的细胞代谢活动、生长都 停止，因而排除了遗传性状的变异，同时保存了细胞 的活力和形态发生潜能。 低温冰冻过程中，细胞内水分结冰会直接破坏细胞结 构。因此在冰冻过程中，通过避免或尽量减少其细胞 内水分结冰而达到冰冻保存的目的。 低温冰冻过程中，细胞内水分结冰会直接破坏细胞结 构。因此在冰冻过程中，通过避免或尽量减少其细胞 内水分结冰而达到冰冻保存的目的。

45 二、超低温保存的基本程序 二、超低温保存的基本程序 植物材料（培养物）的选取 植物材料（培养物）的选取 材料的预处理 材料的预处理 冷冻处理：分慢冻法、快冻法、预冻法、干冻法 冷冻处理：分慢冻法、快冻法、预冻法、干冻法 冷冻贮存 冷冻贮存 解冻：分快速解冻、慢速解冻 解冻：分快速解冻、慢速解冻 再培养 再培养

46 离体保存种质的遗传完整性 影响离体保存种质遗传完整性的主要因素 影响离体保存种质遗传完整性的主要因素 外植体类型 外植体类型 培养基成分 培养基成分 保存方法 保存方法 保存时间 保存时间

47 思考题： 1 、简述体细无性系变异的概念及优缺点。 1 、简述体细无性系变异的概念及优缺点。 2 、利用植物体细胞无性系变异现象，设计获 得耐盐（或耐旱、抗病等）优良番茄株系的基 本程序。 2 、利用植物体细胞无性系变异现象，设计获 得耐盐（或耐旱、抗病等）优良番茄株系的基 本程序。

48 3 、植物种质资源离体保存有何意义？ 3 、植物种质资源离体保存有何意义？ 4 、超低温保存的原理是什么？它的基本操作 程序有哪些？ 4 、超低温保存的原理是什么？它的基本操作 程序有哪些？ 5 、影响种质离体保存遗传稳定性的因素有哪 些？如何减少种质离体保存过程中的变异？ 5 、影响种质离体保存遗传稳定性的因素有哪 些？如何减少种质离体保存过程中的变异？