Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Agustina Setiawati, M.Sc., Apt.

Presentasi serupa


Presentasi berjudul: "TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Agustina Setiawati, M.Sc., Apt."— Transcript presentasi:

1 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Agustina Setiawati, M.Sc., Apt

2 Kloning  DNA Cloning – the act of making many identical copies of a particular piece of DNA (often a gene)  As you know, the first stop often involves joining a piece of DNA of interest to a cloning vector using DNA ligase

3 Prinsip DNA rekombinan

4 PEMOTONGAN HpaI

5 PEMOTONGANPEMOTONGAN EcoRI

6

7

8 LIGASI

9 VEKTOR KLONING

10 Plasmid  DNA untai ganda sirkuler, ekstrakromosom  Linier : Streptomyces rochei  Ukuran : 2,2 kb – 700 kb  Jumlah duplikat: 1-2; 4-8; 20-30,

11

12

13

14 Penamaan plasmid  p : plasmid  BR : pembuat Bolivar dan Rodriguez  322 dibuat lebih awal drpd pBR325, pBR328

15 Pembuatan Plasmid rekombinan

16 VEKTOR PLASMID pBr322

17

18 KLONING DENGAN VEKTOR pBR322

19 Deteksi adanya klon yang diinginkan

20 VEKTOR PLASMID puc18/19

21 Keuntungan pUC  Jumlah duplikat 500 – 700 plasmid/sel  Mudah mendeteksi % plasmid rekombinan  Adanya polycloning sites  pUC18 = pUC19, polycloning sitesnya berlawanan  Membawa promoter lacUV dan ribosome binding site

22

23 Deteksi adanya klon yang diinginkan

24

25 Plasmid Polylinkers and Marker Genes for Blue-White screening  A vector usually contains a sequence (polylinker) which can recognize several restriction enzymes so that the vector can be used for cloning a variety of DNA samples.  Colonies with recombinant plasmids are white, and colonies with nonrecombinant plasmids are blue.  Example: pUC19  Resistant to ampicillin, has (amp r gene)  Contains portion of the lac operon which codes for beta- galactosidase.  X-gal is a substrate of beta-galactosidase and turns blue in the presence of functional beta-galactosidase is added to the medium.  Insertion of foreign DNA into the polylinker disrupts the lac operon, beta-galactosidase becomes non-functional and the colonies fail to turn blue, but appear white. DNA rekombinan pada plasmid

26

27 KEMUNGKINAN BERHASIL  PERSAMAA CLARCK DAN CARBON  N = ln(1 – P)/ln(1 – F)  P : probalitas 0,99  F : ukuran sisipan/ukuran kromosom  N : jumlah koloni dg plasmid rekombinan

28 Koloni yang dibutuhkan  Ukuran kromosom4.000 kb  Ukuran rata-rata sisipan7,7 kb  N=ln(1-99)/ln(1-7,7/4000) = 2390 koloni  Manusia 4x106 kb

29 Kloning gena isulin manusia  Ukuran kromosom 4x109 pb  Ukuran gena isulin pb  Ukuran sisipan pb  N = ln(1-0,99)/ln(1-104/4x109)  Jika sisipan pb N = ?

30 TRANSFORMASI

31

32

33 KLONING GENA EUKARIOT

34

35 STRATEGI KLONING GENA EUKARIOT  Isolasi total mRNA dari jaringan ttt  Ubah mRNA menjadi cDNA  Sisipkan pada vektor ekspresi  Penapisan klon  Produksi enzim

36 RNA processing

37

38 Produksi Insulin Proinsulin

39 Berg JM, et al, 2002

40 Pembuatan cDNA

41

42

43

44

45

46

47

48

49 DETEKSI PROTEIN PADA SEL HOST DENGAN PELACAK DNA

50 DETEKSI PROTEIN PADA SEL HOST

51 Want to know more? Just ask!

52 MATUR NUWUN


Download ppt "TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Agustina Setiawati, M.Sc., Apt."

Presentasi serupa


Iklan oleh Google