Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

1 Klasifikasi, Mekanisme dan Aplikasi Enzim DNA Ligase Abdul Arifin 20508013.

Presentasi serupa


Presentasi berjudul: "1 Klasifikasi, Mekanisme dan Aplikasi Enzim DNA Ligase Abdul Arifin 20508013."— Transcript presentasi:

1 1 Klasifikasi, Mekanisme dan Aplikasi Enzim DNA Ligase Abdul Arifin

2 Klasifikasi DNA Ligase Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) Enzim Nomenklatur DNA Ligase (ATP) EC Definisi; DNA Ligase: salah satu enzim ligase yang membentuk ikatan kovalen fosfodiester diantara ujung 3’Hidroksi dari satu nukleotida dengan ujung 5’fosfat dari nukleotida yang lain dan melibatkan ATP dalam reaksinya. Struktur molekul Mekanisme Reaksi Secara Umum; (DNA)n + (DNA)m (DNA)n+m ATP DNA Ligase AMP + Ppi Sisi Aktif (Lysine)

3 3 NH-AMP DNA ligase NH 2 ATP PP 1 T4 E.coli NAD + NMN AMP Ligated DNA Mekanisme DNA Ligase Suatu rantai DNA yang terpisah Pembentukan intermediate enzim energi tinggi dengan transfer gugus adenosil dari NAD + atau ATP pada gugus amino dari residu lysine Transfer gugus adenosil ke ujung 5’ fosfat pada DNA yang terpisah Gugus hidoksil menyerang ujung 5’ fosfat – adenosil - enzim

4 Tipe-tipe DNA Ligase Pada Hewan Mamalia terdapat 4 tipe spesifik dari enzim DNA Ligase, diantaranya ; DNA Ligase I : yang mengkatalis reaksi ligasi fragmen-fragmen Okazaki pada pemanjangan rantai sewaktu proses replikasi DNA berlangsung dan beberapa fragmen-fragmen rekombinasi DNA Ligase II : Bentuk alternative dari DNA Ligase III yang ditemukan pada sel yang tidak dapat membelah diri DNA Ligase III : Bentuk kompleks dengan XRCC1 suatu protein yang memperbaiki DNA dengan mencegah terjadinya mutasi penghilangan basa DNA dan fragmen-fragmen rekombinan DNA Ligase IV : Bentuk kompleks dengan XRCC4. Kompleks enzim ini mengkatalisis tahap akhir proses perbaikan penggabungan ujung non-homolog DNA rantai ganda. Umumnya enzim-enzim DNA ligase pada mulanya ditemukan dalam T4 bakteriofag, E. coli dan bakteri lainnya.

5

6 Regulator DNA Ligase Regulation of DNA Ligase activity by poly(ADP-ribose) yang disusun oleh Debbie Creissen dan Sydney Shall dalam Nature 296, (18 March 1982) Cell cycle regulation of a DNA ligase-encoding gene ( CaLIG4 ) from Candida albicans Disusun oleh Andaluz, E., et. al., yang dipublikasikan dalam Yeast volume 15 issue 12, 1999, p Regulation of inter- and intramolecular ligation with T4 DNA ligase in the presence of polyethylene glycol yang disusun oleh Hayashi, K., et. al., yang dipublikasikan dalam Nucleic Acids Research, 1986, vol. 14, No Polyethylene glycol (PEG) mempengaruhi reaksi ligasi pada T4 DNA ligase. Dalam 10% (w/v) larutan PEG 6000, hanya ligasi intermolekular yang dipertinggi oleh kation-kation monovalent, sementara reaksi ligasi inter- dan intramolekular dapat terjadi tanpa PEG. Nuclear ADP-ribosyl transferase (ADPRT) menkatalisis transfer ADP-ribos dari NAD + ke protein Kromatin untuk membentuk mono-,oligo-, and poly (ADP-ribose)-termodifikasi. Enzim ini sangat tergantung DNA untuk aktivitasnya dan diaktivasi dengan adanya celah dalam DNA. Hal ini mengindikasikan biosintesis poly(ADP-ribose)n dibutuhkan untuk perbaikan yang efektif untuk beberapa jenis kerusakan DNA. menjelaskan tingkat transkripsi enzim CaLIG4 dalam C. albicans bervariasi selama siklus sel ragi. Sel-sel yang baru terbentuk mengandung tingkat transkripsi basa yang meningkat sampai tingkat maksimum ketika sel dalam keadaan G 1 akhir. Sesudah itu, tingkat ranskripsi menurun ketika replikasi DNA dimulai.

7 pisahkan gen DNA ligase menjadi DNA rantai tunggal dengan pemanasan 94 o C selama 1 menit gabungkan primer ke rantai tunggal DNA, dengan suhu 50 o C/140 detik Annealing Denaturasi pembentukan rantai ke dua dengan DNA polymerase dan dNTP pada suhu 72 o C selama 1,5 menit Extension Dilakukan PCR sampai 40 siklus, Fragmen yang dihasilkan (total panjang 600nt), yang mirip dengan gen DNA ligase organisme x Isolasi gen DNA ligase dari Thermococcus sp Isolasi dan Karakterisasi DNA Ligase Primer merupakan urutan daerah dari DNA ligase organisme x

8 Primer 1 and 2 Membentuk gen utuh. Gen DNA ligase utuh DNA Thermococcus sp Isolasi gen DNA ligase dari Thermococcus sp. 1591

9 Karakterisasi DNA Ligase Salah satu sampel ditambahkan DNA ligase Aktivitas ligase dapat ditentukan melalui dua metode 1.Molekul DNA kontrol 2. DNA setelah penambahan enzim restriksi BstEII 3. Sama seperti 2, tetapi sebelum elektroforesis sampelnya dipanaskan 70 o C selama 10 menit 4. Sampel fragmen DNA + BstEII dengan penambahan DNA ligase (45 o C/1jam), buffer reaksi serta ATP 5. Mirip dengan 4 tetapi tanpa ATP C = produk ligasi (fragmen A + B) A dan B= fragmen hasil restriksi BstEII

10 Aplikasi DNA Ligase Percobaan pertama DNA rekombinan 1971 ilmuwan memanipulasi DNA dan menempatkannya ke dalam bakteri 1972 ilmuwan menggabungkan dua molekul DNA dari sumber berbeda menggunakan endonuclease EcoRI (untuk memotong) dan DNA ligase (untuk menggabungkan kembali)

11 Aplikasi DNA Ligase Kloning DNA pertama  Boyer, Helling Cohen, dan Chang menggabungkan fragmen-fragmen DNA dalam sebuah vector, dan mentransfer ke sel E. coli  Cohen and Chang menyimpulkan, mereka dapat menempatkan DNA bakteri ke dalam spesies bakteri yang berlainan  Tahun 1980 Boyer and Cohen menerima paten untuk metode dasar transformasi dan kloning DNA

12 Pemasukan gen ke dalam plasmid menggunakan enzim restriksi dan DNA ligase 1 Agrobacterium Ti plasmid T DNA Titik restriksi pengenalan ke dalam sel tanaman yang dikembangkan 2 Rekombinan Ti plasmid Plant cell T DNA pembawa gen baru dalam kromosom tanaman Regenerasi tanaman 3 Tanaman hasil rekayasa DNA mengandung gen yang diinginkan Aplikasi DNA Ligase DNA ligase dimanfaatkan untuk menggabungkan secara kovalen ikatan fragmen-fragmen suatu DNA, secara luas kemampuan ini diaplikasikan ke penggabungan suatu fragmen DNA pada suatu vektor plasmid, hal ini merupakan teknik dasar rekombinasi DNA Organisma Modifikasi Genetik: Aplikasi DNA Ligase dalam Agriculture

13 Isolat DNA dari dua sumber 1 E. coli Potong kedua DNA dengan enzim restriksi yang sama 2 Plasmid Sel Manusia DNA Gen V Sticky ends campurkan DNA; mereka bergabung berdasarkan pasangan basanya 3 DNA ligase menggabungkan ikatan DNA secara kovalen 4 Rekombinan DNA plasmid Gen V plasmid dimasukkan ke bakteri 5 bakteri diklon 6 Klon bakteri mengandung duplikat gen manusia Perkembangan Aplikasi DNA Ligase Paul Berg, Stanley N. Cohen & Herbert Boyer, 1970 (p.1119) Klon DNA : (teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetik) 1. Potong DNA pada posisi tertentu dengan enzim restriksi endonuklease. 2. Gabungkan kedua fragmen DNA dengan DNA ligase. 3. Pilih molekul kecil yang mampu mereplikasi DNAnya sendiri. Potongan DNA dapat dimasukkan ke dalam kloning vektor (plasmid atau viral DNA) untuk membentuk DNA rekombinan. 4. Pindahkan DNA rekombinan dari tabung tes ke sell induk untuk replikasi. 5. Identifikasi cell induk yang mengandung DNA rekombinan.

14 Tanaman tembakakau, diekspresikan dengan gen firefly luciferase Beras ini dapat menolong mencegah terjadinya defisiensi terhadap vitamin A “Beras Keemasan” telah dimodifikasi secara genetik agar meengandung beta-karotene Tikus Rekayasa (Kanan), yang diekspresikan dengan gen HGH (Human Growth Hormone) Kloning Sel-sel Hewan, Langkah menuju gen terapi

15 Sel-sel dan organisme rekombinan digunakan untuk menghasilkan protein-protein yang bermanfaat

16 Kesimpulan


Download ppt "1 Klasifikasi, Mekanisme dan Aplikasi Enzim DNA Ligase Abdul Arifin 20508013."

Presentasi serupa


Iklan oleh Google