Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Reaksi PCR Drs. Sutarno, MSc., PhD.. STRUKTUR DNA.

Presentasi serupa


Presentasi berjudul: "Reaksi PCR Drs. Sutarno, MSc., PhD.. STRUKTUR DNA."— Transcript presentasi:

1 Reaksi PCR Drs. Sutarno, MSc., PhD.

2 STRUKTUR DNA

3

4 PCR  Thermocycler = mesin PCR = Mesin DNA  PCR ( polymerase chain reaction ): teknik untuk mengamplifikasi (melipat gandakan) DNA secara invitro.  PCR sangat spesifik, hanya fragmen DNA yang diinginkan yang diamplifikasi, dan  sangat sensitif, tidak lagi memerlukan jumlah DNA dengan ukuran mikrogram, tetapi secara teori meskipun dari singel sel saja akan dapat diamplifikasi dengan PCR.

5 Kegunaan PCR  Untuk skrining atau sekuensing secara cepat  Sebagai pelacak peristiwa kriminal pada bagian forensik  Diagnosa secara dini penyakit hepatitis B, TBC dll  Mendeteksi bakteri patogen dalam air dan lingkungan (sensitivitas 1-10sel/100ml air).

6 Protokol reaksi PCR  Siapkan campuran reaksi yang terdiri dari:  200ng DNA template,  0.15  M dari masing-masing oligonukleotida primer,  200  M dari masing-masing dNTPs,  2mM MgCl2,  10x buffer dan  1,5 unit Taq DNA polymerase  dalam 0,6ml tabung effendorf dengan total volume 50  L  Kontrol negatif (tanpa DNA template) selalu disertakan dalam semua reaksi  melakukan siklus PCR

7 Siklus PCR  Denaturasi :94 o C, 15 detik  Primer annealing :55 o C, 30 detik  Primer extension : 72 o C, 1.5 menit  Akhiri siklus terakhir dengan perpanjangan pada 72 o C selama 5 menit. Kemudian hentikan dengan mendinginkan pada suhu 4 o C dan menambahkan 10mM EDTA (bila diperlukan).

8 Hal-hal penting yang perlu diperhatikan dalam reaksi PCR 1. Konsentrasi enzim  Taq DNA polimerase, konsentrasi: unit per 5  L reaksi. Perlu optimisasi. Konsentrasi enzim terlalu tinggi  background non-spesifik, terlalu rendah  tidak cukup produk. 2. Konsentrasi dNTPs  Konsentrasi masing-masing dNTPs: 200  M  hasil yang baik. Pengurangan konsentrasi dNTPs dapat mengurangi mispriming pada tempat-tempat bukan target, dan mengurangi kemungkinan perluasan kesalahan penggabungan nukleotida.

9 3. Konsentrasi Magnesium  Sangat penting untuk dioptimumkan konsentrasinya.  Mg mempengaruhi: penguatan primer (primer annealing), suhu peruraian pada template, spesifikasi produk, formasi primer- dimer, dan aktifitas serta fidelitas enzim. Masing-masing reaksi PCR diperlukan mM melebihi konsentrasi dNTP. EDTA dalam stok primer dapat mengganggu konsentrasi optimum mg.

10 4. Primer  Umumnya antara  M (+12pM lebih baik). Terlalu tinggi konsentrasi primer: terjadi kesalahan priming (mispriming) dan penumpukan hasil yg tidak spesifik serta menyebabkan munculnya primer-dimer (independent template),  produk yg diinginkan menjadi rendah.  Usahakan G-C content sekitar 50-60%, melting temperatur antara o C.  Primer annealing: tergantung pada komposisi dasar, panjang dan konsentrasi primer, normalnya 5 o C dibawah melting temperaturnya (hasil terbaik biasanya antara o C). Peningkatan suhu annealing dapat menyedikirtkan kesalahan pemanjangan nukleotoda.  Primer extension, tergantung pd panjang dan konsentrasi target sekuen serta temperatur; optimumnya 72 o C.

11 5. DNA template  200ng DNA template, terlalu tinggi  non-spesifik produk. 6. Waktu dan suhu denaturasi  Denaturasi DNA template yg tidak komplit  kegagalan PCR. Umumnya 94oC selama 30detik atau 97oC selama 15 detik cukup bagus. GC content tinggi, perlu suhu denaturasi sedikit lebih tinggi. 7. Jumlah siklus  tergantung konsentrasi permulaan DNA target bila parameter yg lain baik. Terlalu banyak siklus  non- spesifik background; terlalu sedikit  produk sedikit. Antara umumnya memberikan hasil yg baik.

12 Hasil Reaksi PCR setelah elektroforesis  Figure 1. Photograph of an ethidium bromide stained agarose gel showing the specificity of the PCR products (223 bp) of locus 1 spanning intron IV and Exon V of the growth hormone gene, amplified using primers GH1 and GH2. Lane 1: Madura 1 (M1), 2: (M2), 3: Bali 1 (B1), 4: (B2), 5: Ongole derived1 (PO 1), 6: PO bp marker bp 100bp 600bp

13 Hasil PCR-RFLP setelah dilakukan elektroforesis  Figure 1. Photograph of an ethidium bromide stained agarose gel showing the specificity of the PCR products (223 bp) of locus 1 spanning intron IV and Exon V of the growth hormone gene, amplified using primers GH1 and GH2. Lane 1: Madura 1 (M1), 2: (M2), 3: Bali 1 (B1), 4: (B2), 5: Ongole derived1 (PO 1), 6: PO bp marker bp 100bp 600bp

14  Figure 2. Gel photographs showing growth hormone gene polymorphisms detected by PCR-RFLP using Alu I in locus 1 fragment. Lane1 = LV, Lane 2 = VV, Lane 3 = LL, and lane 4 = Uncut. 100bp marker bp 100bp 600bp 171bp 52bp


Download ppt "Reaksi PCR Drs. Sutarno, MSc., PhD.. STRUKTUR DNA."

Presentasi serupa


Iklan oleh Google