MACAM-MACAM PANDANGAN BIOTEKNOLOGI Wiseman : Principle of Biotechnology Smith, J.E. : Biotechnology Principle Thorwald,E. : Biotechnology Brown : Gene Clonning

PENDAHULUAN BIOTEKNOLOGI : Kesepakatan para ahli diberikan untuk / sinonim dengan : REKAYASA GENETIKA (genetic enggineering). Tetapi lebih dari itu ada 3 pengertian tambahan : Isolasi dari makhluk hidup 2. Ekstraksi Produk Metabolisme hasil manipulasi gen, misal esktraksi produk hormon 3. Studi Biologi (biomolekuler) dan Biokimia pada sel hidup atau komponen sel atau keduanya dengan bantuan enzim REKAYASA GENETIKA : Usaha memilih gen khusus kemudian merekombinasikan sebagai DNA primer kemudian diinsersikan dan digandakan sebagai rekombinan DNA dalam sel (sel target)

BIOTEKNOLOGI (Definisi paling luwes) PENERAPAN PRINSIP-PRINSIP SAINS DAN REKAYASA TERHADAP PEMROSESAN BAHAN DENGAN MENGGUNAKAN AGEN BIOLOGIK UNTUK MENGHASILKAN BARANG DAN JASA

Bio(tekno)logi Molekuler Penerapan Ilmu mempelajari sifat, sifat, fungsi dan interaksi molekul-molekul yang ditemui pada organisme Biomolekul : Senyawa-senyawa kimia yang secara alami hanya ditemukan pada makhluk hidup. Komposisi Biomolekul suatu organisme akan menentukan suatu organisme Fungsi-fungsi kehidupan life functions pada dasarnya merupakan manifestasi interaksi biomolekul

BIOTEKNOLOGI MODERN Menetapkan Peranan Gen Dalam Sel Sama artinya dengan Manipulasi Gen = DNA Rekombinan Menetapkan Peranan Gen Dalam Sel DNA merupakan molekul utama kehidupan DNA pemberi kode untuk tumbuh dan berbiak DNA “otak” semua sel, dari DNA keluar perintah mengatur sifat dan jumlah jenis molekul DNA pembuka rahasia cetak biru genetik makhluk hidup DNA merupakan bahan genetik primer, terletak eksklusif pada kromosom sbg.histon DNA merupakan protein genetik,salah satu buktinya DNA pada virus

RUANG LINGKUP BIOTEKNOLOGI Bioteknologi merpakan penerapan biosains dan teknologi penerapan organisme hidup atau komponen sub-selulernya pada industri jasa dan manufaktur serta pengelolaan lingkungan Cakupan : Transformasi kimia Produksi sel/biomassa

1. Transformasi kimia : a. Pembentukan produk akhir : enzim, antibiotik, asam organik, steroid b. Penguraian bahan baku : dekstruksi buangan industri, degradasi tumpahan minyak 2. Produksi Sel/Biomassa : Produksi protein sel tunggal, produksi khamir makanan (Food yeasts). Reaksi-reaksi kimia proses bioteknologi, bersifat Katabolik : kompleks sederhana Anabolik : sederhana kompleks

Keuntungan Proses Bioteknologi Cenderung lebih ekonomis Pemakaian energi lebih sedikit Lebih aman >< proses tradisional Residu dapat terurai, hingga tak beracun 5. Jangka panjang memberikan harapan pemecahan masalah utama dunia : pangan, polusi, obat2an, sumber enersi baru.

Sejarah Evolusi Bioteknologi 1. Proses Bioteknologi Tidak steril 2. Proses Bioteknologi steril 3. Bioteknologi Makanan Minuman Kuno (zaman Louis Pasteur) 4 Bioteknologi Modern a. Rekombinan DNA/Rekayasa genetika b. Teknologi Enzim (amobilisasi enzim) c. Rekayasa Biokimia ( Bioreaktor dengan Komputerisasi ) d. Rekayasa Sistem Produksi (Sensor baru)

REPLIKASI,TRANSKRIPSI, DAN TRANSLASI Replikasi : Proses pembelahan asam nukleat untai ganda manjadi untai tunggal. Proses pembelahan untai gandamenjadi tunggal yang identik melalui proses replikasi “semi konservatif” Model replikasi :bentuk O,bentuk Y, D-loop,DNA sirkul;er, sirkuler berulang,

Garpu Replikasi Garpu replikasi (Replication fork) Melibatkan enzim-enzim Topoisomerase I (Gyrase) Helikase Single strand binding protein (SSBP) Primase DNA polimerase III partikel Okazaki DNA polimerase I lagging strand DNA ligase

Penjelasan 1.Primase :Sintesis RNA primer 2.DNA Pol III: Sintesis untaianDNA baru 3. DNA Pol I : Memindahkan primer RNA 4. Helikase: Menyusunbentukan heliks 5. SSBP: Stabilisasi untaian tunggal 6. DNA ligase: Menggabungkan yang masih terjadi gap 7. Topoisomerase: mengurangi terjadinya supercoils (bentukan seperti spiral yang mengganggu)

PROSES REPLIKASI DNA Tahap Permulaan (Inisiasi) Tahap Pemanjangan (Elongasi, Polimeri sasi) Tahap penghentian (Terminasi) 1. Tahap INISIASI : Origin: Pemisahan dua untai DNA Gelembung replikasi  Garpu replikasi Penyediaan bahan dasar d-TTP,CTP,GTP,ATP Pembentukan primer

2. Tahap Pemanjangan 1. Arah pemanjangan rantai 5’-3’ 2. Nukleotida tersusun mpk komplemenDNA template 3. Pasangan DNA, A dengan T, C dengan G 4. Pasangan pada RNA A dengan U Pemanjangan RNA “primer”,dengan kaidah : 5. “Primer RNA “ melekat di belakangnya. 6. Replikasi berlangsung kedua arah

3.Penghentian (Terminasi) Pembuangan RNA primer pada potongan Okazaki Memanjangkan rantai DNA dengan ligase, melepas RNA primer Berhenti (stop)

TRANSKRIPSI Transkripsi: Proses pembentukan RNA dari DNA Ada 3 macam bentuk RNA : Messenger RNA (m-RNA) Transfer RNA (t-RNA) Ribosomal RNA (r-RNA)

Penjelasan m-RNA,t-RNA,r-RNA m-RNA: membawa sekuen pengkode a.a. dari suatu nukleotida atau lebih yang spesifik pada gen atau satu set gen t-RNA: penghubung untuk membaca informasi pada m-RNA dan mentransfer ke sistem sintesis protein R-RNA: molekul yang menyatukan diri dengan protein membentuk mesin sintesis protein. Molekul itu disebut ribosom

TRANSLASI Translasi: Penyusunan rantai polinukleotida Berlangsung dalam ribosom Urutan a.a. disusun dengan bantuan t-RNA Susunan mengacu urutan kodon m-RNA Kodon pertama pada m-RNA di dekat ujung 5’ berinteraksi dengan t-RNA yang telah membawa a.a. yang berada pada gugus terujung amino bebas molekul protein Demikian seterusnya pemanjangan rantai polinukleotida

Gen, Ekspresi Gen, dan Mekanisme Kerja Gen 1865MendelTeori Gen 1900de Vries dkk. mengujimenerimaTeori Mendel 1902de Vries  Teori mutasi 1913Morgan Gen terdapat dlm kromosom 1944Avery, Mc Leod, Mc Carty Gen = DNA 1953Watson & Crick DNA heliks ganda GENENZIM 1961Brenner dan JacobsDNAm-RNAProtein Gen : POTONGAN URUTAN NUKLEOTIDA(BASA N) YANG MAMPU MENGKODA PEMBANTUKAN RNA PROTEIN

MEKANISME KERJA GEN GARRORD (1909). Alkaptunoria (penyakit metabolik herediter, karena ketiadaan suatu enzim pemecah cincin benzena pada urineurin mengandung cincin benzena. GEN ENZIM ? BEADLE & TATUM (1942). Mutasi pada Neurospora crassa menyebabkan hilangnya enzim2 tertentu. GEN = ENZIM

LANJUTAN MEKANISME KERJA GEN PAULING (1949) Sickle Cell Diseases. Adanya Hb abnormal GEN PROTEIN BRENNER & JACOBS (1961) menemukan m-RNA dikukuhkan “dogma sentral” Gen (DNA) m-RNAProtein, penjabarannya : Urutan nukleotida DNA Urutan nukleotida RNA Urutan asam amino protein

UNSUR2 GENETIK PENGENDALI EKSPRESI GEN Gen-gen yang berperan dalam pengendalian ekspresi gen adalah : 1. R = Represor, pengendali sistem enzim perangsang. Pada E. coli nampak adanya perangsang (inducers) timbul untuk membuat enzim β-galaktosidase (bila ada laktosa sebagai sumber makanan). Adanya laktosa sangat meningkatkan kecepatan RNA polimerase mengkode gen penghasil enzim β-galaktosidase

LANJUTAN UNSUR2 GENETIK PENGENDALI EKSPRESI GEN 2.P = PROMOTOR. Tanda mulai (start) untuk mensintesis RNA, pada tempat ini RNA polimerase mengikat diri pada permulaan suatu operon 3. O = OPERATOR. Tempat kedudukan untuk melekatnya perangsang represor 4. S = STRUKTURAL. Tempat kedudukan gen-gen untuk proses translasi (sesuai dengan kode-kode genetik yang menyusunnya)

MUTASI Mutasi : Perubahan Genetik Menetap Percobaan in vitro membuktikan bahwa ada : Mutasi Titik (Point Mutation): Pengganti- an satu nukleotida dengan nukleotida lain. Delesi (Deletion):Penghapusan satu atau lebih nukleotida Insersi (Insertion): Penambahan satu atau lebih nukleotida Unequal Cross Over: Persilangan gen menjadi tidak seiring/sesuai dengan pasangan aslinya

PENJELASAN MUTASI Mutasi Titik : Mutasi titik merupakan penggantian satu nuleotida dapat merubah satu asam amino (a.a.) pada protein atau tidak Bila perubahan tsb. tidak merubah a.a., maka mutasi tsb. hanya dapat diketahui dengan menentukan urutan nukleotida pada DNA atau m-RNA disebut Mutasi tersembunyi (Silent Mutation) Contoh : UUG Leu UUA Leu

LANJUTAN PENJELASAN MUTASI TITIK Bila penggantian nukleotida merubah asam amino : UUGleu UUGleu UUGleu    UUCphe UCGser GUGval ada 3 macam akibat : Fungsi protein tak terganggu Fungsi ptoein menurun Protein tak berfungsi Terminasi prematur, Contoh : CAAUAA stop

PENJELASAN DELESI dan INSERSI Delesi: Terhapusnya satu atau lebih nukleotida menyebabkan terjadinya pergeseran tanda baca. Protein menjadi tidak berfungsi Tanda baca tak berubah bila delesi meliputi 3 nukleotida secara berurutan Insersi : Penambahan nukleotida juga menyebabkan pergeseran tanda baca Protein tak berfungsi Terminasi prematur Unequal Cross Over : Sudah jelas di pel. Genetika SLTA/SMU

KL0NING (1) Latar Belakang Pentingnya Kloning (DNA Rekombinan): - Belum jelasnya transkripsi dan translasi, dan kode genetik pada gen-genTuntutan: Sifat gen harus dapat diwariskan Tuntutan: Mekanisme kerja gen harus dapat diramalkan hasilnya Tuntutan: Peningkatan kualitas dan uantitas pada dunia aplikasi

KLONING (2) Pengertian Kloning Gen : 1 Fragmen DNA diinsersikan pada DNA sirkuler sebagai vektor sbg. Wahana, 2 Vektor pembawa gen masuk ke dalam tuan rumah (host), biasanya baketri, 3 Vektor berreplikasi 4 Sel tuan rumah membelahreplikasi vektor selanjutnya 5 Klon sel host yang identikklon mengandung 1 atau lebih mol DNA rekombinan

Langkah2 Dasar dlm Kloning Gen Memotong Gen Menyisipkan Gen pada Vektor Menata Mol. DNA Rekombinan Memasukkan ke dlm sel tuan rumah Multiplikasi Mol. DNA Rekombinan dlm. Sel tuan rumah Perbanyakan Sel Pengujian klon2 sel yang yang mengandung DNA rekombinan di media agar (padat)

Pengamatan dengan Elektroforesis

Southern Blotting

Agrobacterium

Wahana/Vektor/Vehicle Wahana: Pembawa gen masuk ke dlm. Sel tuan rumah Harus memiliki sifat: Mampu memasuki sel tuan rumah Mengadakan replikasi utk. Menghasilkan kopi (bertanggung jawab atas hasil replikasinya) Ada 2 mol alamiah wahana : Plasmid Kromosom virus/bakteriofaga

Ciri2 Dasar Plasmid Ciri dasar plasmid : DNA sirkuler yang terdapat bebas dalam sel bakteri Membawa satu gen atau lebih yang mempunyai ciri-ciri penting Semua plasmid memiliki paling sedikit satu urutan DNA yg. bertindak sbg. asal replikasi Berapa plasmid dpt. Mengadakan replikasi Contoh: * Kemampuan hidup bakteri dlm antibotik disebabkan permbawa gen resisten antibiotik

Kopi Plasmid Faktor yang berpengaruh thd. jumlah molekul plasmid dlm. bakteri blm. diketahui Jumlah kopi tiap plasmid khas 1-50 Kopi plasmid bermampuan terhadap sifat resistensi thd. antibiotik Ukuran molekul kecil < 10 kilobasa (Molekul besar cenderung pecah waktu pemurnian & Lebih sulit dimanipulasi

Klasifikasi Plasmid Ada 5 jenis utama: Plasmid fertilitas (“F”), hanya membawa gen tra, hanya melakukan transfer gen dgn. cara konjugasi. Contoh: Plasmid F. E.coli. Plasmid Resistensi (“R”), membawa gen penyebab resistensi bakteri. Contoh: RP4 Plasmid Col.: Mengkode Kolisin.Contoh: Pada E.coli. Plasmid Degradatif. Memetabolisme mol. Yang tidak biasa. Contoh: Plasmid. Tol. Plasmid Virulensi. Penyebab patogenitas pada bakteri tuan rumah. Contoh: Plasmid Ti

Gambar-gambar Plasmid (1)

Gambar-gambar Plasmid(2)

Gambar-gambar Plasmid (3)

Mikroba mengandung plasmid (4)

Gambar Plasmid pBR322

Gambar Plasmid pUC18/19

Plasmid makhluk tk. rendah - tk.tinggi Pada Saccharomyces cerevisiae 2μm circle Pencarian plasmid pada eukariota (filamentosa, tanaman, hewan) selalu gagal, diperkiranakan pada organisme tingkat tinggi memang tidak punya plasmid.

Bakteriofaga Bakteriofaga: virus yang menginfeksi bakteri Struktur: Sederhana t.d. 1 mol. DNA (kadang-kadang RNA) membawa sejumlah gen, “tubuhnya” dikelilingi kapsid.

Microinjection

Melakukan Microinjection