Uji Fotometri DR. Pingkan Aditiawati

I. Pendahuluan Pengujian fotometri antibiotika dilakukan berdasarkan: (1) pengetahuan interaksi organisme dan inhibitor; (2) pengukuran fotometri turbiditas (kekeruhan). Manfaat  pengukuran turbiditas meningkatkan keakuratan pengujian. Automatisasi diterapkan pada pengujian turbidimetri. Pada kuliah ini juga akan dibahas mengenai penemuan prosedur yang membantu dalam pengujian dengan cara baru.

II. Kinetika Interaksi Obat dan Mikroba Pada bagian ini akan dibahas mengenai: Zat kimia yang meningkatkan pertumbuhan Zat kimia penghambat pertumbuhan

Zat Kimia yang Meningkatkan Pertumbuhan Interaksi antara zat kimia yang meningkatkan pertumbuhan dengan mikroba meningkatkan massa Zat kimia yang diperlukan oleh mikroba adalah zat yang tidak dapat disintesis oleh mikroba tersebut. Zat kimia yang ditentukan secara kuantitatif dengan metode mikrobial  asam amino, vitamin B, kmponen organik, dan mineral. Pengujian dilakukan untuk mengetahui  zat kimia yang esensial untuk pertumbuhan organisme, organisme itu sendiri, dan pengukuran defisiensi zat kimia tertentu pada medium. Pengujian kinetika merupakan pengujian sederhana dan telah dikenal secara luas  dimana organisme dapat tumbuh jika ada zat kimia (obat), dan sebaliknya tidak akan tumbuh jika tidak ada zat tersebut. Waktu inkubasi dan komposisi medium dengan adanya zat kimia pada tabung hanya merupakan faktor pembatas. Pada keadaan tersebut  jumlah massa sel proposional dengan jumlah zat kimia dalam tabung,. Pada kondisi ini merupakan kebutuhan minimum untuk keakuratan pengukuran turbiditas dalam menguji vitamin.

Zat Kimia Penghambat Pertumbuhan Interaksi antara zat kimia penghambat pertumbuhan dengan mikroba menurunkan produksi. Pengujian zat kimia penghambat pertumbuhan dilakukan untuk mengetahui zat kimia apa yang dapat mengurangi kecepatan pertumbuhan atau memperpanjang fase lag mikroba, kerentanan organisme terhadap kerja dari zat kimia (obat), uji fotometri, dan mengetahui respon medium cair terhadap obat. Kinetika penghambat pertumbuhan mikroba oleh zat kimia (obat) sangat kompleks, disebabkan oleh beberapa cara penghambatan: (a) zat kimia membunuh seluruh bakteri; (b) zat kimia hanya membunuh sebagian populasi; (c) zat kimia mengurangi kecepatan pertumbuhan populasi secara bersamaan /serentak; (d) zat kimia mengurangi kecepatan pertumbuhan dengan cara yang tidak bersamaan; (e) zat kimia memperpanjang periode lag; (f) beberapa kombinasi yang telah diuraikan diatas. Salah satu cara yang telah banyak dipelajari mengenai interaksi mikroba dengan zat kimia (obat) adalah dengan cara menghitung jumlah bakteri sebagai fungsi dari waktu dan konsentrasi antibiotik.

III. Penyebaran Cahaya oleh Mikroorganisme Cahaya akan disebar oleh partikel koloid, seperti suspensi bakteri. Distribusi sudut penyebaran cahaya oleh partikel berbentuk bola, kira-kira sama dengan ukuran panjang gelombang cahaya. Distribusi penyebaran cahaya berbeda-beda untuk setiap organisme. Pengukuran distribusi penyebaran cahaya dapat digunakan untuk menentukan ukuran partikel dan mengidentifikasi bakteri tertentu. Manfaat distribusi sudut penyebaran cahaya untuk analisis mikrobiologi pengukuran transmitan pada sistem fotometri. Dimana kekeruhan suatu suspensi meningkatkan, makan panjang gelombang cahaya menurun. Struktur bagian dalam sel bakteri sangat kompleks, jika terjadi perubahan struktur maka akan merubah penyebaran cahaya. Peningkatan ukuran bakteri berbentuk bola selama siklus pertumbuhan akan merubah absorbansi suspensi secara proporsional. Kesimpulan: absorbansi  mengukur total massa atau volume

IV. Pengukuran Turbiditas (kekeruhan) Pada bagian ini akan dijelaskan mengenai Peralatan Aplikasi Kalibrasi peralatan

Peralatan Fotometer digunakan untuk mengukur turbiditas suspensi bakteri. Fotometer jika digunakan dengan kurva kalibrasi yang diperoleh dari pertumbuhan suatu organisme, maka dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi organsime yang sama. Garis kalibrasi akan berbentuk kurva pada konsentrasi yang tinggi  berasal dari hukum Beer. Kekeruhan dihitung berdasarkan Hukum Beer: I/Io= exp (-N Eab), dimana: N= konsentrasi bakteri; E= koefisien partikel; a= area efektif partikel secara optis; b= kekeruhan suspensi. Log Io/I = A=OD=N Eab/2,3 Pada suspensi yang diencerkan, a dan E adalah konstan. Pada fotometer, b= ketebalan cuvette (juga konstan), sehingga persamaan dapat ditulis : log Io/I = A = OD = DN ( persamaan yang umum digunakan dalam mikrobiologi), dimana: A=absorbasni; D=konstan; OD= optical density Keakuratan pengukuran turbiditas diperlukan untuk memperoleh metode turbidimetri yang potensial dalam pengujian mikrobiologi, sehingga diperlukan peralatan yang stabil.

Aplikasi Manfaat menggunakan alat pengukur turbiditas adalah: (1) menentukan ukuran rata-rata bakteri dari pengukuran yang tidak simetri (2) menghitung konsentrasi bakteri untuk mempelajari pertumbuhan dan pengujian. Turbiditas diukur dengan metode fotometri  absorbansi suspensi

Kalibrasi Peralatan Turbiditas suspensi bakteri menentukan dalam pengujian secara mikrobiologi  diukur dengan fotometer. Hubungan antara pembacaan skala dengan konsentrasi suspensi bakteri  nonlinier, diatas kisaran konsentrasi. Penggunaan spektrofotometer yang stabil dan voltmeter digital untuk mengukur output spektrofotometer akan meningkatkan keakuratan pengukuran. Semakin akurat pengukuran akan menunjukkan kurva kalibrasi peralatan sedikit berbeda untuk organisme yang berbeda, selain itu warna organisme mempengaruhi bentuk dari kurva METODE GRAFIK Hubungan antara turbiditas dengan konsentrasi organisme: OD=AN – BN2, dimana A dan B karakteristik konstanta pada alat pengukur, dan 100 N adalah konsentrasi (biasanya tidak diketahui) organisme yang mengukur 10,0% T / transmitan (OD=1,00) pada panjang gelombang yang spesifik. Definisi N (konsentrasi bakteri)  berubah-ubah, secara jelas N dapat ditetapkan dengan cara lain. Alat pengukur menunjukkan turbiditas dalam OD, %T, atau voltase, sehingga N: N={A [A2 - 4B(OD)}1/2}/ 2B = {A - [A2-8B+4B log T]1/2}/2B

Plot OD terhadap N berupa garis lurus dengan mempertahankan A dan kemiringan B. (Lihat Gmbar disamping) Nilai N (respon terhadap alat), tergantumg pada opacity, ukuran, bentuk, dan warna organisme. Opacity berkorelasi dengan kandungan sel. Opacity sel hidup berbeda dengan sel yang mati. Koefisien A dan B berbeda untuk panjang gelombang yang berbeda. BN2 menunjukkan resultan cahaya yang hilang oleh banyaknya penyebaran cahaya. Nilai A akan meningkat dengan menurunnya panjang gelombang cahaya. OD dengan konsentrasi bakteri 100N akan sama dengan 100 A jika B=0. Panjang gelombang yang biasa digunakan adalah 550-650nm.

Contoh kurva kalibrasi pada beberapa organisme (lihat gambar disamping). Kurva digunakan untuk mengubah pengukuran turbiditas menjadi jumlah bakteri yang proporsional pada konsentrasi bakteri.

Perhitungan N Antibiotik dan vitamin menyebabkan respon yang sensitif. Respon ditunjukkan dengan perubahan dalam konsentrasi organisme. Untuk kalibrasi diasumsikan N adalah konsentrasi bakteri (pengukuran N lebih mengukur massa daripada jumlah) Nilai N sebagai fungsi dari konsentrasi zat kimia/obat yang aktif lebih berarti daripada % T atau OD sebagai variabel dependent. Hubungan antara N dan OD dapat ditulis dalam persamaan berikut: N = (OD)+ (OD)

V. Garis Dosis-Respon Pendahuluan Garis dosis-respon merupakan bagian fundamental dalam pengujian mikrobiologi. Garis dosis respons  hubungan antara respons organisme dan konsentrasi zat kimia aktif. 3 jenis garis dosis respons yang umum digunakan - uji difusi - uji turbidimetri zat kimia yang meningkatkan pertumbuhan, seperti vitamin - uji turbidimetri zat kimia yang menghambat pertumbuhan, seperti antibiotika dan desinfektan Pada bagian ini juga akan dibahas mengenai: - Pengukuran pertumbuhan - Zat kimia yang meningkatkan pertumbuhan - Zat kimia yang menghambat pertumbuhan - Uji garis dosis-respons

Pengukuran pertumbuhan Pengukuran pertumbuhan dibuat sebelum garis dosis respon dibuat  berdasarkan konsentrasi bakteri yang berasal dari pengukuran turbiditas/kekeruhan Pengukuran turbiditas  jumlah konsentrasi bakteri yang proporsional. Nilai absolut konsentrasi bakteri tidak ditambahkan dalam pemembuatan garis dosis respons, konsentrasi bakteri diberikan dalam unit relatif. Suatu unit yang tepat menunjukkan nilai 100 pada konsentrasi 10 % T atau OD= 1,00 Konsentrasi organisme absolut  OD 1,00 merupakan fungsi dari gelombang cahaya, kedalaman optik terhadap cuvette, ukuran dan warna organisme, dan geometri alat Kurva oleh 1 organisme (misal S. aureu) tidak digunakan untu mengkonversi pengukuran organisme lain untuk unit konsentrasi relatif, jika diperlukan keakuratan.

Zat Kimia yang Meningkatkan Pertumbuhan Zat kimia yang diperlukan untuk meningkatkan pertumbuhan mikroorgansime diuji untuk metode mikrobiologi. Pengujian terhadap asam amino dan vitamin dilakukan dalam skala besar. Seringkali metode mikrobiologi lebih spesifik, sensitif dan lebih mudah ditampilkan daripada metode kimia. Organisme uji  beberapa bakteri asam laktat Meskipun organisme uji memiliki kebutuhan absolut terhadap vitamin, tetapi total pertumbuhan organisme tergantung pada nutrisi esensial lainnya, seperti vitamin yang akan diuji. Komposisi medium, kosentrasi vitamin dan kondisi pertumbuhan  ditentukan, sehingga total pertumbuhan dibatasi oleh vitamin (berarti respon suatu sistem terbatas hanya pada 1 variabel) Garis dosis respon untuk uji vitamin dan asam amino adalah: N= A + BC, dimana N = konsentrasi bakteri C = konsentrasi zat kimia essensial untuk pertumbuhan Jika medium tidak terkontaminasi dan mengandung zat kimia yang akan diuji, maka A = 0, dan B adalah kemiringan garis

Tiga jenis kurva yang menggambarkan garis dosis respons, dapat dilihat pada gambar disamping: - Garis No.1 kurva ideal, medium bebas kontaminasi, dengan vitamin B12 dan teknik yang baik -Garis No.2  menunjukkan adanya kontaminasi, dengan sedikit vitamin B12, tetapi memberikan hasil yang memuaskan -Garis No.3  menunjukkan kekurangan vitamin, uji ini tidak dapat digunakan.

Zat Kimia yang Menghambat Pertumbuhan Antibakteri diuji dengan mengukur respon pertumbuhan bakteri yang rentan terhadap antibakteri. Dua parameter pertumbuhan bakteri yang dipengaruhi oleh antibakteri adalah kecepatan pertumbuhan dan fase lag. Pada bekteri yang mati kecepatan pertumbuhan bakteri = 0 dan periode lag tidak terbatas. Antibiotikmengurangi kecepatan pertumbuhan bakteri. Zat kimia penghambat pertumbuhan akan membunuh organisme uji  memperlama fase lag dan mengurangi kecepatan pertumbuhan

Di bawah ini beberapa asumsi yang dibuat untuk membuat suatu persamaan matematik 1. Perubahan suhu inkubasi dan komposisi medium terjadi selama inkubasi. 2.Keadaan /kondisi inkubasi  identik untuk seluruh tabung uji 3.Seluruh bakteri yang tumbuh dalam tabung masih dalam fase log saat inkubasi berakhir. 4.Periode lag dan konsentrasi zat kimia aktif  berkorelasi dengan: L = L0 + aC, dimana L0 = periode lag dengan tidak ada zat kimia aktif a = konstanta C = konsentrasi zat kimia penghambat 5.Waktu generasi konstan (konstanta kecepatan pertumbuhan k)  konstan sepanjang periode inkubasi untuk nilai C tertentu.

6.Kecepatan pertumbuhan konstan (k)  fungsi linear dari konsentrasi zat kimia penghambat pertumbuhan pada saat zat kimia mempengaruhi kecepatan pertumbuhan (kecuali sulfonamid) k = k0 - kaC, dimana k0 = kecepatan tanpa konsentrasi zat kimia C dan ka koefisien penghambat 7. Zat kimia tidak dikonsumsi oleh organisme uji 8. Peningkatan jumlah bakteri yang tumbuh dalam waktu tertentu ( t ), tanpa zat kimia penghambat, ditunjukkan dengan persamaan berikut: N = N0 exp k (t-L), dimana N0 = jumlah awal sel N = jumlah sel setelah waktu inkubasi t Substitusi untuk nilai k dan L maka persamaan diatas menjadi: N = N0 exp (k0-kaC)[t- (L0 + aC)] atau log N = 0,4343 (k0-kaC)[t- (L0 + aC)] + log N0

Penghambat pertumbuhan secara bersamaan (uniform) Zat aktif yang menurunkan kecepatan pertumbuhan 4 respons berbeda yang disebabkan inokulum atau kondisi zat kimia aktif yang mempengaruhi atau tidak mempengaruhi fase lag 1. Antibakteri tidak berpengaruh pada periode lag, sehingga a = 0. Inokulum dalam fase log, L0 = 0. Maka persamaan dapat ditulis sebagai berikut: log N = 0,4343 (k0-kaC)[t- (L0 + aC)] + log N0 persamaan diatas menunjukkan garis dosis-respons untuk penicilin, eritromisin, tylosin,kloramfenikol dan tetrasiklin .Persamaan diatas juga dapat ditulis dalam bentuk uji dosis-respon: log N = A – BC, saat waktu inkubasi konstan seperti pada uji antibiotika umumnya, dimana, A = 0,4343 k0t + log N0 B = 0,4343 kat 2. Zat kimia aktif menyebabkan periode lag, dimana a > 0. Inokulum berada dalam periode log, maka L0 = 0, sehingga diperole persamaan: log N = 0,4343 (k0-kaC)(t- aC) + log N0 Pada saat t konstan dalam suatu uji maka: log N = A-BC + 0,4343 (k0aC2-k0aC) Plot dari log N terhadap C bukan merupakan gari lurus, melainkan berbentuk kurva.

Gambar dibawah ini menunjukkan garis C>0 dengan kemiringan garis k0-kaC Gambar dibawah ini menunjukkan garis untuk nilai C>0

Gambar yang menunjukkan garis dosis-respons yang tepat untuk pengujian

3. Zat kimia aktif yang tidak bekerja saat periode lag, dimana a = 0 3. Zat kimia aktif yang tidak bekerja saat periode lag, dimana a = 0. Inokulum berada pada periode lag, maka L0 >0 log N = 0,4343 (k0-kaC)(t- L0 ) + log N log N = A-BC + 0,4343 (k0-kaC) L0 4. Zat kimia yang meningkatkan periode lag, sehingga a >0.Inokulum berada dalam periode lag, dimana L0 >0. log N = 0,4343 (k0-kaC)[t- (L0+aC ) + log N log N = A-BC - 0,4343 (k0-kaC) (L0+aC) 5. Penghambatan sulfonamid terhadap E. coli berbeda dari sistem yang lainnya. Kecepatan pertumbuhannya konstan, k bukan merupakan fungsi linier dari konsentrasi zat kimia (obat), melainkan: k = k0 – C/( + C) dimana  = 1/ka dan  dan  konstan untuk sulfonamid dan sistem uji. Kerja obat diperlambat dalam suatu waktu (K), yang konstan untuk setiap suhu inkubasi dan tidak tergantung pada konsentrasi obat. Pengujian pengaruh K dimulai pada saat t-K dengan inokulum log Nk = 0,4343k0K + log N0, sebagai pengganti log N0 pada t = 0. Pada saat inokulum berda pada fase log, persamaan pertumbuhan menjadi: log N = 0,4343[(k0-C/( + C)](t-k) + 0,4343k0K +log N0 atau log N = 0,4343k0t-0,4343[C/( + C)](t-k) + log N0 k = 0 saat C = 0 tidak menghambat pertumbuhan dihitung dari log N = 0,4343k0t+ log N0

Zat kimia aktif yang mempengaruhi periode lag, dimana ka = 0 1. Inokulum berada dalam fase lag, dimana L0 = 0. Maka diperoleh persamaan: log N = 0,4343 (k0)(t-aC)+ log N0 atau log N = A – 0,4343 k0aC 2. Inokulum berada dalam fase lag, dimana L0 > 0. Maka diperoleh persamaan: log N = 0,4343 (k0)[t – (L0 + aC)] + log N0 log N = A – 0,4343 k0 [L0 + aC] untuk waktu yang tetap

Penghambat Pertumbuhan Nonuniform Terdapat 4 kategori untuk tiap perlakuan 1. Populasi memiliki 2 kelas kecepatan pertumbuhan, yaitu 0 dan tidak terhambat. 2. Seluruh sel dipengaruhi oleh derajat yang berbeda, sehingga kecepatan pertumbuhan tiap individu sel bervariasi. 3. Fase lag seluruh sel dipengaruhi oleh derajat yang berbeda 4. Kombinasi 2 dan 3

Kasus 1 menunjukkan all or none situation Kasus 1 menunjukkan all or none situation. Keadaan dimana sel tumbuh pada kecapatan normal untuk medium dan suhu atau tidak tumbuh sama sekali. Set  = fraksi sel yang tidak tumbuh 1-  = fraksi sel yang tumbuh pada kecepatan normal Persamaan pertumbuhan menjadi : N = N0 ( 1-) exp [k ( t – L) +  N0 Untuk mengeneralisasikan set  = f ( C ), maka N = N0 [1-f C] exp [k (t- L)] + f (C) N0 Untuk waktu yang tetap dalam pengujian, dimana exp [k (t – L)] = a, konstanta = A. maka: N/N0= A[1- f ( c )] + f (c) = A + f ( c )[1 – A] A adalah suatu konstanta, 1 – A adalah konstanta untuk waktu. Grafik N/N0 terhadap C akan dalam bentuk f ( c ). Semakin besar , semakin kecil inokulum yang efektif dan semakin lama waktu inkubasi yang diperlukan untuk mencapai konsentrasi sel standar.

Asumsi yang sama L = L0 + aC dan k = k0 – kaC Persamaan umum untuk menggambarkan keempat kategori penghambatan yang non-uniform pada pertumbuhan dapat ditentukan. Kategori 2 dan 3 adalah kasus khusus untuk kategori 4. Asumsi yang sama L = L0 + aC dan k = k0 – kaC Penyederhanaan asumsi yang dibuat  adanya jumlah terbatas kecepatan pertumbuhan dan periode lag. Jika tiap-tiap sel memiliki kecepatan pertumbuhan dan periode lag yang berbeda dengan yang lain pada populasi, maka jumlah akan terbatas, meskipun besar. Asumsi selanjutnya yang dibuat  beberapa (n) subpopulasi yang terpisah satu sama lain dapat dibedakan dan seluruh sel dalam subpopulasi mempunyai kecepatan pertumbuhan dan waktu lag yang sama. Ini dapat diasumsikan dengan memilih cukup subpopulasi kecil atau dengan memberikan batasan yang cukup luas untuk parameter.

Inokulum N0 terdiri dari n subpopulsi masing-masing mengandung N0, cell pada saat ke-I pada n subpopulasi. Ukuran populasi setelah inkubasi waktu ke-t dapat digambarkan sbb:

Perumusan pada persamaan 21 adalah jumlah dari 4 kompenen, yaitu: 1. Yang diakibatkan oleh seluruh parameter yang sama 2. Perbedaan antara a dan ai 3. Perbedaan antara ka dan kai 4. Kedua set yang berbeda

Kasus 2  identik dengan kasus 4 (persamaan 22) saat fase lag sama pada seluruh sel (a1 = a untuk seluruh i) Kasus 3  kategori yang terdiri dari sistem dengan variasi periode lag yang sangat luas. Seluruh kelompok diasumsikan memiliki kecepatan pertumbuhan sama kai = ka untuk seluruh i

Pengujian Garis Dosis-Response Uji kekeruhan/turbidimetri dikerjakan dengan sangat presisi dengan peralatan yang automatis  kesalahan kecil Interpolasi dari kurva standar biasa  sulit untuk dikerjakan dangan sedikit kesalahan dari beberapa % kemampuannya . Dari kurva dosis respons harus dipilih seminimal mungkin kesalahan interpolasi. Gambaran singkatnya, alat digunakan dalam menentukan ilustrasi data  dengan memplot garis dosis respon. Turdibiditas diukur dengan alat ukur spektrofotometer dengan panjang gelombang 550 nm. Untuk uji vitamin dibuat grafik OD terhadap C atau N terhadap C. Grafik hubungan N terhadap C  lebih baik digunakan untuk mempelajari permasalahan yang dihadapi dalam pengujian. Interpolasi dari garis log OD terhadap C lebih akurat untuk pengujian.

Untuk pengujian antobiotik, gunakan grafik yang menghasilkan garis lurus dan kemiringan yang terbaik  saat respons alat tergantung pada variabel Plot log-probability antibiotik yang berhubungan saat diuji pada sistem yang sama memiliki kemiringan yang sama, tetapi dengan MR yang berbeda (MR = ordinate intercept of a 50 % end point) antibiotik yang tidak berhubungan biasanya memiliki kemiringan yang berbeda Perubahan pH medium uji biasanya mempengaruhi MR bukan kemiringan garis Plot log –probability  untuk mempelajari secara detail pengujian, dengan membandingkan strain organisme yang sensitif dan membandingkan sensitivitas (MR) organisme lain terhadap antibiotik. Beberapa metode kerja uji turbidimetri terhadap antibiotik  membuat konsentrasi kurva standar pada skala logaritmik. Hasil kurva standar diplot sebagai logaritma OD terhadap konsentrasi antibiotik Desain diuji dengan menggunakan sistem AUTOTURB untuk menguji eritromisin. Lihat tabel berikut ini:

VI. Uji Kesalahan Uji kesalahan berasal dari banyak sebab: 1.Sumber kesalahan pertama adalah pertimbangan terhadap standard and sampel. Kesalahan biasanya 0,2% atau lebih kecil dari 0,2%, tetapi dapat mencapai 1% atau lebih pada saat sampel sangat sedikit dan tidak tepat. Pertimbangan kesalahan seharusnya kurang dari 0,5 % jika > 100 mg. 2.Kesalahan pada pengenceran standard dan sampel untuk pengujian konsentrasi. Jika menggunakan 1 ml pipet volumetrik dan 100 ml volumetrik flash kesalahan pengenceran 1 %. 3.Penggunaan pipet yang lebih besar akan mengurangi kesalahan. Kesalahan dalam pengukuran volume sampel dan inkubasi  kesalahan kurang dari 0,1 %. Kesalahan tangan pada saat pemipetan volume sampel dapat lebih besar 4. Kesalahan pada saat inkubasi

5. Kesalahan saat mengakhiri pertumbuhan organisme dan mempersiapkan suspensi untuk pengukuran turbiditas Pertumbuhan seluruh organisme pada seluruh tabung uji harus diakhir pada saat yang sama, meski hanya berbeda 1 menit akan menyebabkan kesalahan. 6. Kesalahan dalam pengukuran kekeruhan dengan metode fotometer 7. Kesalahan dalam interpolasi dari kurva standar

Keakuratan/Presisi Prosedur statistik terbaik akan membuat uji ke-2 tidak tergantung pada uji pertama, pada saat mengerjakannya pada hari ke-2. Uji turbidimetri terdiri dari 6 urutan pengerjaan sebagai berikut : 1. Sampling dan pertimbangan 2. Pengenalan pada tahap pengujian 3. Pengukuran volume sampel dan medium cair 4. Inkubasi 5. Pengukuran turbiditas 6. Interpolasi dari kurva standar dan menghitung kemampuan/daya dari sampel tersebut

Kontrol Sampel dan Keakuratan Biasanya “kontrol” sampel sangat tidak murni. Selang kepercayaan 95% dibuat tidak berubah pada beberapa uji  Jika uji satu sampel pada uji hasilnya tidak baik, maka seluruhnya akan tidak baik. Uji yang tidak baik dapat disebabkan oleh pengerjaan yang tidak baik (seperti kesalahan dalam pemipetan) Keakuratan uji diukur dengan perbedaan antara menetukan jawaban dan jawaban yang benar. Jawaban benar suatu standar diketahui saat 1 dari beberapa elemen dari kurva standar menggunakan metode yang akurat. Metode uji harus memiliki nilai  harus menentukan perlakuan standar sebagai sampel dengan keakuratan yang dapat diterima . Dapat diterima  masing-masing metode ditentukan oleh analis Metode uji untuk antibiotika dalam makanan diterima jika jawaban + 20 % dari nilai standar sebenarnya. Metode yang digunakan untuk mengontrol grade pahrmaceutical produk akan disebut akurat jika dapat mengukur standar +3 % dari nilai yang diketahui

VII. Automatisasi Discrete System Sekarang ini semakin luas melakukan uji kimia secara automatisas. Beberapa perusahaan  memproduksi peralatan khusus: 1.Pfizer. Salah satu sistem automatis yang terkenal  Chas. Pfizer & Co, yaitu mesin yang besar dan kompleks memproses sampel dengan kecepatan 60 sampel/jam. 2.Abbott. Mesin automatis untuk uji mikrobiologi  seluruh fermentasi beer dan juga untuk uji turbidimetri erithromycin. 3.Lilly. AUTOTURB, yaitu suatu sistem untuk mengukur sampel, alat ini mudah digunakan, sederhana, biaya rendah, efisien dan akurat. 4.Upjohn. Automatisasi sistem untuk mambaca hasil uji fotometer 5. Lain-lain  Gulandi and Morisi menciptakan peralatan yang dapat digunakan untuk mendeterminasi fotometer dan uji mikrobiologi.

Continuous Flow Systems Prosedur aliran continuous menggunakan komponen sistem Auto- Analyzer untuk menguji antibiotik. Dua prosedur pengerjaannya adalah turbidimeter dan respirometer Pengujian dengan analyzer sangat baik diguankan pada sampel yang sangat murni mengontrol pembentukan dosis antibiotika Lebih ekonomis daripada uji difusi Pengujian dengan metode turbidimetri, memerlukan peralatan yang kompleks, waktu yang panjang untuk start-off, dan pengerjaan harus hati-hati, serta memerlukan teknisi yang terlatih

VIII. Desain Uji Antibiotik Pendahuluan Diperlukan 2 jenis pengujian 1. Keakuratan pengujian untuk mengukur kuantitas zat kimia dalam penyediaan komposisi awal zat kimia/obat yang murni. Uji harus akurat  karena kesalahan menyebabkan peningkatan biaya. Uji ini dilakukan untuk mengontrol pembentukan dosis. 2. Uji harus sangat sensitif  untuk dapat mengukur konsentrasi zat kimia/obat dalam ukuran kecil pada berbagai materi biologi yang jumlahnya besar. Uji ini biasanya digunakan untuk mengukur antibiotik dalam serum, urin dan pakan ternak. Uji yang baik memerlukan desain dan kerja yang baik Desain termasuk dalam pemilihan organisme uji, komposisi dan preparasi medium, inokulum, waktu dan suhu inkubasi, konsentrasi zat kimia, pH medium, respons, dan bantuan mekanis Pengerjaan  aktivitas, pelatihan, motivasi, pekerja (yang tidak dikerjakan oleh mesin secara otomatis)

Kecakapan 1.Pembuatan uji yang baru  memerlukan tenaga ahli, peralatan dan tempat. Tim pengembangan produk terdiri dari seorang peneliti senior dan 1-3 asisten Laboraturium. Peralatan yang diperlukan sistem autoturb (atau sejenisnya)  untuk uji Fotometer. Tempat yang cukup untuk alat dan pekerja (ruang tertutup, tidak membuat keributan, dll). 2.Pengujian rutin Peralatan minimum untuk uji fotometer, yang akan memproses 60 sampel dan memerlukan standard. Kapasitas untuk uji dengan cawan petri  48 sampel dan memerlukan standard. Pengembangan pengujian rutin harus dikerjakan oleh orang yang berbeda. Supervisor memonitor pekerjaan dan menjawab penyimpangan yang terjadi, sehingga kualitas pekerjaan dengan standar, hasilnya akan baik. Pada pengujian rutin  pekerja harus menentukan jawaban yang benar jika terjadi penyimpangan. Jangan mengerjakan seorang yang sering memodifikasi pekerjaan tanpa mengerti akibat yang ditimbulkan oleh modifikasi tersebut terhadap pengujian.

Penelitian Pendahuluan Suatu uji antibiotika yang baru harus melalui beberapa tahapan pengujian sebelum uji yang akurat dilakukan Uji yang pertama adalah: streak plate, serangkaian pengenceran atau metode disc-plate dengan menggunakan preparasi kering sebagai petunjuk standar. Setelah produk hampir murni dan masing-masing tahapan pemurnian tidak merpengaruhi kemurnian  keakuratan uji harus ditingkatkan untuk mengukur kemajuannya. Uji fotometri atau uji difusi yang akurat diperlukan dan juga setelah antibiotik menjadi produk komersil. Komponen zat kimia dan spektrum anti bakteri ditentukan dengan menggunakan bahan mentah selama tahap awal pembentukan. Jika komponennya memiliki aktivitas melawan bakteri gram positif  diuji dengan S.aureus (dengan konsentrasi zat kimia antara 0,1 dan 10 mg/ml pada tabung uji untuk mendapatkan uji yang memuaskan tugas analis)

Jika uji belum memuaskan  analis harus meneruskan pekerjaannya. Indikasi kisaran sensitivitas suatu sistem uji harus ditemukan sebelum uji dapat mendekati kisaran sebenarnya. E.coli dan S.aureus  rentan terhadap thimerosal dan ph hanya sedikit mempengaruhi kerentanan Salmonella gallinarum secara signifikan lebih rentan daripada bakteri lain dan uji lebih sensitif pada pH 8 daripada pH 7 Uji standar hygromycin B  B subtilis dengan metode plating dan aktivitasnya yang diharapkan melawan bakteri gram positif. Tetapi bagaimanapun hanya men-trace aktivitas pada S.aureus Diperlukan sensitivitas tambahan untuk uji hygromycin B, yang ditunjukkan oleh kerja dalam medium dengan fosfat rendah pada pH 8

Preparasi Sampel Preparasi sampel dapat mempengaruhi uji  pengaruh konsentrasi zat kimia penghambat dan zat kimia yang meningkatkan pertumbuhan secara simultan Komponen jenis pertama memberikan interferensi/gangguan positif dengan meningkatkan potensi sampel. Komponen jenis kedua menurunkan potensi sampel dengan merangsang pertumbuhan organisme uji pada tabung. Keduanya perlu diselidiki pengaruhnya yang saling meniadakan Preparasi sampel harus sesederhana mungkin

Bagaimana gangguan pada sampel dapat diselidiki? 1.Dengan cara membuat kurva standard dosis-respons yang akurat (uji sampel pada beberapa jenis konsentrasi dan uji dilakukan berulang kali) 2. Jika uji gagal dan menunjukkan adanya gangguan dan permasalahan dalam analisis. 3. Jika potensi menunjukkan 2 dari uji kuantitas pada sistem AUTOTURB berbeda 5 %, interferensi diperkirakan 10 %  dipastikan ada interferensi.

Interferensi disebabkan oleh sesuatu dalam sampel, dimana pada standard tidak terdapat kekurangan Misal : vitamin dalam ekstrak pakan hewan  (penambahan vitamin berlebihan dalam medium akan mengurangi bias, tetapi interferensi positif dapat dideteksi) dalam pakan hewan interferensi positif dan negatif dapat diamati Vitamin, asam amino, purin, pirimidin, mineral dan gula dalam ekstrak menyebabkan peningkatan kecepatan pertumbuhan organisme. Kontaminasi merubah kecepatan pertumbuhan 0,1%  perubahan pertumbuhan mungkin ditunjukkan sebagai bias dalam uji. Sampel dengan proses fermentasi  dapat menimbulkan permasalahan, karena banyaknya variasi dalam nutrisi dan juga banyaknya agen antibakteri. Ekstraksi dan pengenceran untuk pengujian konsentrasi merupakan metode utama yang dilakukan dalam preparasi sampel.

Organisme Uji dan pH Medium Biasanya organisme uji adalah strain bakteri yang terdapat dimana-mana. Bakteri ini dikultivasi untuk beberapa tahun pada medium sederhana dan tumbuh baik dalam medium cair. Bakteri yang sering digunakan dalam uji fotometri dapat dilihat pada tabel I berikut. Lebih banyak lagi spesies bakteri yang harus diselidiki, terutama untuk keperluan pengujian sensitifitas/resistensi terhadap zat kimia ke-2 Salah satu cara termudah untuk merubah sensitivitas sistem uji adalah dengan merubah pH Aturan umum sensitivitas pengujian untuk antibiotik dengan kadar asam (seperti penisilin and sepalosporin) akan meningkat dengan menurunnya pH, dimana antibiotik dasar (seperti eritromisin,streptomisin dan tiolisin) akan meningkat dengan meningkatnya pH dan untuk antibiotik netral (kloromfenikoll) biasanya tidak tergantung pada pH sistem uji. Batas peningkatan dalam sensitivitas disebabkan oleh perubahan pH dibatasi oleh pH pertumbuhan organisme dan uji stabilitas antibiotik Beberapa karakteristik sistem uji dapat dilihat pada tabel II  terdapat daftar antibiotik, uji bakteri, medium, pH, dan laporan sensitivitas sebagai respon medium

Tabel I

Tabel II

INOKULUM Organisme uji (seperti pada tabel I) merupakan strain lama laboraturium dan dipertahankan pada medium agar G dan R No.1 Kultur tusuk (Stab) digunakan untuk S.paecalis dan agar miring untuk organisme yang lain. Pemindahan dilakukan dari agar miring ke agar miring . Seluruh bakteri disimpan/diawetkan dengan cara menyimpan suspensi dalam ampul tertutup dalam nitrogen cair pada pendingin. Seluruh kultur mungkin termutasi dan terkontaminasi Mutan  mungkin lebih resisten dari organisme awalnya. Subkultur harus dikerjakan  menjaga agar kultur tetap murni. Kultur yang baru harus diuji sebelum mengganti kultur yang lama. Inokulum untuk uji  inokulum yang tua, muda, dalam fase lag atau dalam fase log (semuanya dapat digunakan)

Bakteri uji tumbuh dengan baik pada Groth G dan R No 3 pada suhu 37 0 Kultur yang didiamkan semalam (overnight) menghasilkan inokulum dalam fase lag. Pada kultur overnight  tambahkan 0,5% glukosa kocok untuk aerasi, inkubasi selama 2 jam dan inokulum berada pada fase log Seluruh inokulum harus distandarisasi dengan mengukur turbiditas, terutama fotometer harus dikalibrasi. Konsentrasi yang sama pada jenis inokulum yang sama harus digunakan untuk uji khusus. Sampel uji diinkubasi dengan panjang waktu yang sama dan kurva standar akan hampir sama dari hari ke hari Keseragaman respons ditunjukkan oleh kontrol yang dilakukan untuk menambah kepercayaan suatu pengujian. Jenis inokulum dan konsentrasi bakteri yang akan diinokulasikan dalam medium cair uji antibiotik harus ditentukan untuk tiap-tiap zat kimia yang diujikan. Semakin besar konsentrasi bakteri, semakin kurang sensitif terhadap uji dan semakin pendek waktu inkubasi yang diperlukan untuk mencapai populasi standar pada konsentrasi 0 dalam tabung pada pengujian antibiotik. Jenis dan tingkat inokulum harus dipilih untuk mencapai sensitivitas, keakuratan, garis dosis-respons dan waktu inkubasi yang diperlukan. Penting  masing-masing tabung terdiri dari inokulum yang sama karena kesalahan dapat terjadi dalam konsentrasi awal bakteri uji akan menyebabkan kesalahan yang sama pada akhir uji.

Medium dan Buffer Uji medium harus menentukan kebutuhan minimum untuk organisme uji Medium terdiri dari sumber nitrogen, sumber energi, mineral essensial, vitamin essensial, dan zat kimia lain yang diperlukan untuk pertumbuhan. Medium untuk uji antibiotik yang biasa digunakan adalah G dan R N0. 3  terdiri dari campuran produk seperti pepton, ekstrak daging, yeast hidroslisat, casein hidrolisat, NaCl dan Potasium Fosfat. Dengan asumsi medium yang disediakan cukup dalam segala hal dan kebanyakan sama untuk yang lainnya. Tergantung pada organisme uji dan antibiotik yang digunakan medium mungkin tepat, kekurangan atau terlalu kaya nutrisi. Contoh S. aureus yang ditumbuhkan pada media cair G dan R No.3 cukup untuk uji eritromisin dan penisilin, meskipun kekurangan mineral dan vitamin. Penambahan mineral dan vitamin meningkatkan kecepatan pertumbuhan S.aureus (menyebabkan interferensi negatif)

Tersedianya medium yang cukup dan ketersediaan medium untuk beberapa uji sehingga hasil cukup konsisten. Banyak bakteri memerlukan vitamin B (untuk pertumbuhannya). Kebutuhan vitamin untuk organisme uji penting  karena standar dan sampel tidak selalu mengandung konsentrasi vitamin yang sama dan medium tidak mengandung konsentrasi vitamin esensial yang optimal. Tetapi vitamin dalam ekstrak pakan ternak  mengganggu uji antibiotik dengan mengganggu kecepatan pertumbuhan, sehingga hasilnya akan bias. Nutrien lain seperti asam amino dan lemak juga dapat mengganggu uji, tergantung pada kebutuhan organisme uji dan komposisi medium. Medium sintetik jarang digunakan dalam uji antibiotik. Medium harus dipersiapkan dengan prosedur dan komposisi yang akurat  semaikin sedikit langkah kerja, semakin besar kemungkinan pengerjaan tanpa kesalahan.

pH medium sangat penting. Pada uji antibiotik, misalnya: pH 6,7,8  untuk uji penisilin 8  untuk uji tylosin 7  untuk uji eritromisin pH ditingkatkan dengan menambah NaOH pH diturunkan dengan menambah HCl Saat mengerjakan suatu uji yang baru  pH harus diatur untuk memberikan sensitivitas yang diperlukan Karena pH penting  kapasitas buffer medium harus dibuat cukup besar untuk mempertahankan (mendekati) pH yang konstan, setidaknya 2/3 periode inkubasi. pH seluruh medium diukur pada suhu 250 C meningkatnya suhu hingga 380 C pH turun. Medium uji yang disterilisasi dengan pemanasan pada suhu 1210C selama 20 –30 menit  medium akan berubah (ditandai dengan berubahnya warna medium menjadi coklat) Pada beberapa medium uji  perubahan medium tidak menjadi masalah. Sterilisasi medium harus dilakukan jika periode inkubasi overnight atau lebih panjang, atau jika komponen yang akan diisi bukan agen antibakteri.

Buffer merupakan suatu bagian dari sistem uji dan dapat mempengaruhi sensitivitas dan kisaran uji. Setiap buffer harus menunjukkan nilai positif (tidak mengganggu uji)  harus dikerjakan dengan membandingkan respons atnibiotik yang dilarutkan dalam air dengan respons adanya buffer. Buffer dapat disterilisasi dengan autoklaf. Fosfat ditambahkan pada medium  sebagai buffer dan pH tepat Komposisi medium (pengaruhnya terhadap organisme) dipengaruhi oleh bahan medium, perlakukan medium sebelum ditambahkan dan materi lain yang ditambahkan pada inokulum Tidak ada medium optimum untuk uji antibiotik

Melakukan Percobaan Keputusan yang dibuat untuk mendesain suatu uji  Tedapat kisaran uji, organisme, medium dan pH yang digunakan, waktu inkubasi, volume sampel, penambahan medium pada tabung uji, serta jumlah tabung untuk tiap-tiap tahapan standar dan sampel. Contoh : higromisin B dengan kisaran 0,05 – 0,2 /ml diperlukan dalam tabung uji dan dapat dicapai dengan menggunakan S. gallinarum dengan medium khusus dengan kadar fosfat yang rendah. Penambahan volume sampel pada tabung uji tergantung pada peralatan yang tersedia alat ukur otomatis  untuk mengukur sampel volume antara 0,1 – 0,4 ml per tabung, manual  0,5 ml (dengan pipet needle-tipped), 1 ml dengan transfer pipet. Dilakukan pada 2 tabung uji pada tiap tahapan untuk sampel dan standard  cukup Masing-masing sampel harus diuji pada 2 tahapan uji untuk menguji identitas standar dan sampel dan untuk memastikan pada analis bahwa tidak ada interferensi/gangguan (tidak pernah diasumsikan bahwa sampel sangat murni)

Konsentrasi terendah  10 % penghambat pertumbuhan Konsentrasi tertinggi  tidak lebih dari 80% penghambat pertumbuhan organisme uji Jumlah titik pada kurva standar mempengaruhi keakuratan yang diperlukan, kisaran, jenis grafik, dan unit dimana turbiditas diukur. Aturan yang baik  menggunakan rentang yang pendek untuk standard yang mencakup seluruh sampel. Misal: jika sampel dapat diencerkan dalam kisaran yang sempit sebagi preparasi farmasi, kurva standar menjadi pendek (uji preparasi eritromisin  sampel diencerkan + 0,35 dan 0,45 g/ml dan standar 0,3 ,0,4 dan 0,5 g/ml ) Sistem uji antibiotik  bentuk terbaik garis dosis-respons harus sama dari tes ke tes.

Waktu dan Suhu Inkubasi Untuk uji biasanya bakteri tumbuh degan baik pada suhu 37,50 C dan suhu tersebut digunakan untuk uji inkubasi. Sedikit sekali diketahui suhu terbaik yang dapat digunakan dalam sistem uji. Pada sistem uji yang umum  harus diselidiki sensitivitas dan keakuratan Yang terpenting adalah standard dan sampel harus berada pada suhu yang sama Waktu inkubasi beberapa uji dapat sangat bervariasi tanpa mempengaruhi sampel saat menggunakan sistem AUTOTURB atau sejenisnya. Waktu inkubasi yang lama akan mengurangi kemiringan garis dosis respons. Waktu inkubasi dapat ditemukan hanya dengan melakukan percobaan.

Penghentian Pertumbuhan Pengukuran Pertumbuhan Pertumbuhan pada uji bakteri dapat dihentikan dengan pemanasan atau dengan penambahan zat kimia Pengukuran Pertumbuhan Pengukuran turbiditas suspensi bakteri dalam tabungpaling akurat. Turbiditas harus diukur dengan peralatan yang stabil. Kalkulasi Potensi log N terhadap C, log OD terhadap C, dan log C terhadap T berada dalam bentuk yang cukup untuk menghitung potensi dengan menggunakan komputer digital.

Pengujian Metode Menguji setiap titik pada kurva standar sebagai sampel. Mempersiapkan konsentrasi intermediet standard dalam konsentrasi dengan jarak yang berdekatan pada kurva standar Prosedur uji  bebas dari bias, dapat diterima, potensi sampel tidak tergantung pada uji konsentrasi, dan diperoleh secara lengkap penambahan standar pada sampel.

TERIMA KASIH